目前來說，調(diào)控m6A修飾過程的閱讀蛋白共有9種功能，今天不會大家一一來講，而是主要講參與蛋白編碼過程的YTHDF1蛋白，它主要通過與mRNA的m6A位點(diǎn)結(jié)合，在腦神經(jīng)發(fā)育[1]，多巴胺分泌[2]和突觸形成[3]等過程中起重要作用。

文章導(dǎo)讀：

2018年10月31日，美國芝加哥大學(xué)何川團(tuán)隊(duì)，上�？萍即髮W(xué)周濤團(tuán)隊(duì)與賓夕法尼亞大學(xué)宋紅軍團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在Nature期刊發(fā)表論文，首次指出m6A 修飾對小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的影響，今天小編將詳細(xì)對本文進(jìn)行解析，同時(shí)總結(jié)一下近年來何川教授針對閱讀蛋白研究的文章。

• 樣本：野生型小鼠，YTDHF1敲除模型小鼠

• 技術(shù)手段：m6A RNA 甲基化測序，mRNA 測序，CLIP測序和小鼠認(rèn)知相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)等

• 時(shí)間點(diǎn)：初次刺激期，LTP期（刺激反應(yīng)晚期）和二次刺激期

 

本文研究了YTHDF1敲除及野生型小鼠海馬體神經(jīng)受到初次刺激，LTP期和二次刺激后神經(jīng)的表型反應(yīng)，相關(guān)蛋白生成量及前后等電位點(diǎn)閾值的變化情況。

受到初次刺激時(shí)，兩組小鼠對于刺激的表型反應(yīng)差距不大；LTP期，YTHDF1敲除小鼠由于缺乏YTDHF1蛋白從而抑制了LTP相關(guān)蛋白的合成，導(dǎo)致在受到后續(xù)刺激時(shí)，等電位點(diǎn)變化達(dá)不到閾值影響記憶形成的能力。

1. YTDHF1敲除小鼠對空間記憶能力和外界刺激的敏感度差

前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)YTDHF1在小鼠海馬體中高表達(dá)[4]，于是作者通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了YTDHF1敲除的模型小鼠（圖1a），命名為YTDHF1-KO小鼠。與野生型小鼠相比，KO組小鼠在四周歲前，海馬體的組織形態(tài)（圖1b），透明水迷宮訓(xùn)練結(jié)果（圖1c）與正常小鼠一致。而在不視水迷宮訓(xùn)練（圖1d），探頭實(shí)驗(yàn)（圖1e）和對于外界刺激（圖1f，g，h）的敏感度都要長于對照，說明敲除YTDHF1蛋白對空間記憶和外界刺激能力的反應(yīng)起重要作用。 

2. YTDHF1及相關(guān)蛋白參與學(xué)習(xí)和記憶關(guān)鍵的LTP期

作者接著從生理水平觀測敲降組小鼠腦的變化。敲降組突觸電流振幅和頻率比對照組低（圖2 a，b），且形態(tài)比對照組�。▓D2 c，d）。在受到外界刺激時(shí)，神經(jīng)間突觸后電位閾值的變化量低于對照組（圖2 e，f）。同時(shí)，此過程可能與5個(gè)與LTP期關(guān)鍵的突觸后密度相關(guān)的蛋白相關(guān)（圖2 g，h），YTDHF1回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示上述表型又得到了回復(fù)。

3. YTHDF1 CLIP測序揭示m6A peak與突觸傳導(dǎo)和LTP期相關(guān)

為了從分子角度進(jìn)一步解析YTHDF1的作用機(jī)制，作者運(yùn)用YTHDF1-CLIP測序技術(shù)，檢測了小鼠海馬體中（n=3，4只小鼠混為一個(gè)樣本）YTHDF1 mRNA上所有的結(jié)合位點(diǎn)和m6A 位點(diǎn)。通過對三個(gè)樣本的m6A peak峰取交集，在1,042個(gè)轉(zhuǎn)錄本上共找到了3,552個(gè)peak峰（圖4a左）。1,502個(gè)peak與基因組3’UTR區(qū)匹配（圖4 a右）；67%的peak與轉(zhuǎn)錄本匹配，并在3’UTR區(qū)富集（圖4 b）。對上述peaks相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO和KEGG注釋后，發(fā)現(xiàn)其與突觸傳導(dǎo)和LTP期有關(guān)，這也與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不謀而合。

 4. m6A CLIP測序與YTHDF1 CLIP測序聯(lián)合分析篩選到可能與YTHDF1結(jié)合的m6A位點(diǎn)

接著,作者對同類型樣本進(jìn)行了m6A CLIP測序，對三個(gè)樣本分別進(jìn)行motif分析后，發(fā)現(xiàn)三者共有將近有11,000個(gè)序列為GGACU的peaks（圖5 c）。將peak分別于轉(zhuǎn)錄本和基因組比對后，發(fā)現(xiàn)與YTHDF1 CLIP的結(jié)果十分類似(圖5 d，e)。對兩次CLIP實(shí)驗(yàn)的peaks取交集后，發(fā)現(xiàn)共有將近30%的peak（圖5 g），IGV結(jié)果表明：YTHDF1的m6A位點(diǎn)與突觸形成關(guān)鍵蛋白（如Gira1，Grin1和Camk2a等）的m6A位點(diǎn)相近，二者可能通過m6A位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控蛋白的合成（圖5 h）。

5. 首次繪制電休克小鼠的m6A RNA甲基化譜

最后，作者建立了電休克小鼠模型，對海馬體的齒狀回結(jié)構(gòu)的組織進(jìn)行m6A RNA甲基化測序和轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合，快速找到許多既發(fā)生m6A 甲基化表達(dá)量又發(fā)生巨大變化的基因，以供后續(xù)研究。

總結(jié)：

本篇文章表明小鼠海馬體中m6A RNA甲基化能夠調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶的生成，并且可以影響調(diào)控與神經(jīng)形成相關(guān)的關(guān)鍵靶基因的表達(dá)，為今后進(jìn)一步研究m6A修飾在學(xué)習(xí)和記憶分析機(jī)制提供了認(rèn)識。

何川教授m6A RNA甲基化Reader相關(guān)蛋白成果總結(jié)：

 1. 2013.11 Nature IF: 41.58

帶有YTH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白通過mRNA結(jié)合影響功能。

2. 2014.5 Nature IF: 41.58

講明Reader蛋白的作用機(jī)制。

 3. 2015.2 Nautre IF: 41.58

揭示m6A 甲基化結(jié)合蛋白HNRNPC與LncRNA結(jié)合的生物學(xué)功能。

       

4. 2017.4 Cancer Cell IF: 22.84

揭示m6A甲基化結(jié)合蛋白HUR與LncRNA結(jié)合的生物學(xué)功能。

參考文獻(xiàn)：

1. Hess, M. E. et al. The fat mass and obesity associated gene (Fto) regulates activity of the dopaminergic midbrain circuitry. Nat. Neurosci. 16, 1042-1048 (2013).

2. Weng, Y.-L. et al. Epitranscriptomic m 6 A regulation of axon regeneration in the adult mammalian nervous system. Neuron 97, 313-325.e6 (2018).

3. Li, L. et al. Fat mass and obesity-associated (FTO) protein regulates adult neurogenesis. Hum. Mol. Genet. 26, 2398-2411 (2017).

4. Lein, E. S. et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature 445, 168-176 (2007).

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