IRES & 2A peptide大比拼

 

導(dǎo)讀

  Hello! 大家好！有一個(gè)問題不知道大家考慮過沒有：為了研究單個(gè)基因的功能機(jī)制或?qū)崿F(xiàn)多基因協(xié)同表達(dá), 那這種同時(shí)表達(dá)多個(gè)目標(biāo)基因該如何實(shí)現(xiàn)呢？

  實(shí)際上，目前廣泛采用多順反子表達(dá)方案,即利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)或自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)等元件來連接多個(gè)基因,實(shí)現(xiàn)在單個(gè)載體上表達(dá)多個(gè)多順反子的目的。

   那么，IRES和2A peptide各有何特點(diǎn)呢？今天我們就來總結(jié)一下，讓我慢慢道來~
 

IRES
 

     首先，人們發(fā)現(xiàn)，雖然一般真核mRNA的翻譯都需要5’帽子來介導(dǎo)核糖體結(jié)合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體RNA結(jié)合，起始蛋白質(zhì)翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site, IRES）。

   IRES元件具有不依賴帽子結(jié)構(gòu)而獨(dú)立募集核糖體的功能,進(jìn)而可以啟動下游基因的翻譯。眼前一亮有沒有？ 人們可以利用這個(gè)元件進(jìn)行多順反子的共表達(dá)。

 

 

 

Figure 1.A diagram of the Dicistroviridae RNA genome. Dicistroviruses are naturally dicistronic with two open reading frames that are translated by independent IRESs. The non-structural proteins are translated by the 5＇IRES whereas the structural proteins are translated by the IGR IRES. A genome-linked viral protein (Vpg) and the poly(A) tail (An ) are indicated^[1].
 

 

 

 

   內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）是天然存在于一系列mRNA中的翻譯增強(qiáng)子，當(dāng)存在于目的基因之間時(shí)介導(dǎo)翻譯的內(nèi)部起始（圖2）。因此，IRES可以通過設(shè)計(jì)類似于細(xì)菌操縱子的多順反子表達(dá)盒，驅(qū)動由相同mRNA編碼的幾個(gè)基因的翻譯。

    處在IRES元件前后的兩個(gè)基因相對獨(dú)立,可以表達(dá)得到完整的目的蛋白。但由于IRES的結(jié)構(gòu)較大,其應(yīng)用常受到載體容量的限制,并且IRES對位于其后的基因翻譯起始能力相對較弱。

Figure 2. Cap-dependent and internal ribosome entry site-dependent initiation, two alternative mechanisms of translation. A: The so-called cap-dependent ribosome scanning mechanism predicts that ribosome 40S subunit binds to the mRNA 5’ end. Ribosome binding requires the initiation factor 4F (eIF-4F, composed of the three proteins eIF-4E, -4A and -4G). Then the mRNA is unwound under the control of the helicases eIF-4A and -4B, allowing the ribosome to scan the mRNA until recognition of an initiation codon (classically AUG); B: When an Internal ribosome entry site (IRES) is present in the mRNA 5’ untranslated region, IRES trans-acting factors (ITAFs) allow ribosome 40S internal recruitment, independently of the presence of cap and eIF-4F. The IRES-dependent mechanism occurs in the case of picornavirus uncapped mRNAs as well as for cellular capped mRNAs^[2].
 

2A peptide
 

   但是如上所述，IRES有共表達(dá)兩種基因表達(dá)量不均衡的問題，要解決這個(gè)問題，自剪切2A肽的構(gòu)建策略近年來越來越收到了廣泛關(guān)注。

   2A肽被發(fā)現(xiàn)于口蹄疫病毒（FMDV），是從其中鑒定出的一種“自裂解”小肽，其平均長度為18-22個(gè)氨基酸。最初，人們推測病毒編碼蛋白或宿主細(xì)胞蛋白可能無法被切割。然而，該受體介導(dǎo)了在C-末端2A肽上合成異戊酰基脯氨酸肽的三聚體，導(dǎo)致2A肽之間立即被切割，下游肽具有脯氨酸N-末端(圖3)。

Figure 3. Schematic representation of cleavage occurring in a peptide translated in foot-and-mouth disease virus (FMDV). 1D, 2A and 2B indicate contiguous endogenous peptides translated in FMDV. The arrowhead indicates cleavage site^[3].

    2A元件在翻譯過程中形成的高級結(jié)構(gòu)對核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心造成空間位阻,導(dǎo)致無法形成正常的肽鏈連接,但同時(shí)核糖體卻能繼續(xù)翻譯下游蛋白,從而形成一種類似蛋白水解酶的作用將前后兩個(gè)蛋白順式“切開”。

     2A 肽結(jié)構(gòu)短小并且上下游基因的表達(dá)平衡性好。但由于其獨(dú)特的“剪切”機(jī)制,導(dǎo)致最終分別得到一個(gè)融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一個(gè)N端帶有一個(gè)脯氨酸的下游蛋白,額外增加的2A肽結(jié)構(gòu)可能會對目的蛋白的功能造成一定的影響。

Figure 4.(A)Two individual polypeptides can be generated from one transcript using 2A to link the individual genes. (B) 2A peptide sequence and its cleavage site(G/P)^[4]

 

  綜上所述，IRES“同時(shí)轉(zhuǎn)錄，獨(dú)立翻譯”，2A peptide“同時(shí)轉(zhuǎn)錄，同時(shí)翻譯”，兩者都用于多蛋白同時(shí)表達(dá)。但由于IRES和2A peptide兩者各自存在的優(yōu)缺點(diǎn),在體外實(shí)驗(yàn)中人們通常需要構(gòu)建兩種或多種不同的表達(dá)載體來進(jìn)行比較,才能找到最合適的表達(dá)方案。

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參考文獻(xiàn):

[1]Tricks an IRES uses to enslave ribosomes.

[2]Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy.

[3]High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice.

[4]Use of the Foot-and-Mouth Disease Virus 2A Peptide Co-Expression System to Study Intracellular Protein Trafficking in Arabidopsis

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