引言

當(dāng)需要定義一個(gè)數(shù)據(jù)的特征時(shí),如變化的比例、曲線上下邊的漸近線或者 EC50/IC50值時(shí)，選擇正確的曲線擬合方式是十分關(guān)鍵的。選擇的曲線擬合方式應(yīng)該是能夠最準(zhǔn)確的反映兩個(gè)已知變量 (x,y) 的關(guān)系。因此，曲線擬合的目的就是為了尋找最佳的公式和參數(shù)來(lái)匹配數(shù)據(jù)。

SoftMax Pro 7軟件能夠提供 21 種曲線擬合方式，包括四參數(shù) (4P) 和五參數(shù) (5P) 非線性回歸分析。多種的擬合方式選擇，是為了確保能夠找到適合數(shù)據(jù)的最佳擬合方式，并且能夠通過(guò)調(diào)整所選擬合方式的參數(shù)來(lái)得到最能反映濃度響應(yīng)變化關(guān)系的曲線圖。

本文將介紹在 SoftMaxPro7 軟件中能夠運(yùn)用的線性和非線性回歸分析方法。另外，本文還給出了如何利用標(biāo)準(zhǔn)方差和阿凱克信息論準(zhǔn)則來(lái)評(píng)估選擇的擬合方式是否最合適。

優(yōu)勢(shì)

- 利用一種高效免洗實(shí)驗(yàn)方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞活性
- 準(zhǔn)確定量活細(xì)胞或死細(xì)胞
- 通過(guò)預(yù)設(shè)分析模塊快速獲得相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

線性回歸

線性回歸擬合是最常見(jiàn)的數(shù)據(jù)擬合方式。它可以用下面的公式表示出來(lái)，y = A + Bx。其中x代表自變量 ( 一般是濃度等變量 ) ,y 代表因變量；B 值代表的是該公式對(duì)應(yīng)直線的斜率，而 A 值則為 x = 0 時(shí)的 y 軸截距。SoftMax Pro提供三種線性擬合方式：y = A + Bx, semi-log y = A + B* log₁₀ (x), log-log log₁₀ (y) = A +B* log₁₀ (x)。軟件可以通過(guò)數(shù)據(jù)分析中找到最佳的直線公式 ( 圖表1 )。

在計(jì)算線性范圍時(shí)，最小的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)取點(diǎn)為 3 個(gè)，但是更多標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)能夠提高擬合的準(zhǔn)確性。這種擬合方式最大的優(yōu)點(diǎn)就是計(jì)算簡(jiǎn)單。但是，大多數(shù)情況下，數(shù)據(jù)間的關(guān)系都是非線性的。

非線性回歸

在測(cè)量值和變量為非線性關(guān)系時(shí)，通常使用logistic 回歸分析。這種擬合方式的目的是為了找到最佳的公式參數(shù)來(lái)使公式計(jì)算的理論值和測(cè)量值之間的背離最小。為了能夠正確地選擇最佳的擬合方式，需要理解標(biāo)準(zhǔn)的曲線形狀，并將他們與實(shí)際數(shù)據(jù)點(diǎn)的形狀進(jìn)行比較。

SoftMax Pro 軟件提供了 17 種非線性曲線擬合方式。它包括：二次方擬合，三次方擬合，四次方擬合，log-logit，cubicspline，指數(shù)函數(shù)，直角雙曲線，兩參數(shù)指數(shù)函數(shù)，雙指數(shù)函數(shù)，雙直角雙曲線，兩點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)，高斯擬合，Brain-Cousens，四參數(shù)擬合，五參數(shù)擬合和五參數(shù)交替擬合。SoftMax Pro 軟件使用最廣泛使用的迭代過(guò)程，Levenberg Marquardt 算法，來(lái)獲得最佳的非線性擬合方式。四參數(shù)和五參數(shù)擬合是最常見(jiàn)的兩種非線性曲線擬合方式，均適用于 S 形曲線的回歸分析 ( 圖2 )。

這類曲線擬合方式需求至少 4 個(gè)或 5 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，使用 6 個(gè)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)能夠獲得更加準(zhǔn)確的擬合公式。四參擬合表示為下列公式，y = ((A-D) / (1 + ((x/C)^B))) + D。其中 y 是相應(yīng)值，D 值是無(wú)限分析物濃度下的響應(yīng)值，A 是零分析物濃度下的響應(yīng)值，x 是分析物濃度，C 是拐點(diǎn)值 (EC₅₀/IC₅₀)，B 是斜率參數(shù)。而響應(yīng)的變化規(guī)律是：當(dāng)A < D 時(shí)，y 值是正比于 x 值變化的；當(dāng) A> D 時(shí)，y 值是反比于 x 值變化的。四參數(shù)曲線是一個(gè)對(duì)稱的曲線，曲線的一側(cè)和另一側(cè)以 EC₅₀/IC₅₀ 中心點(diǎn)完全點(diǎn)對(duì)稱。而對(duì)于一些免疫實(shí)驗(yàn)或生物測(cè)試的數(shù)據(jù),其數(shù)據(jù)圖形并不對(duì)稱，因此需要而外的變量來(lái)衡量該數(shù)據(jù)的復(fù)雜性。在這種情況下，五參數(shù)擬合方式能夠通過(guò)引入一個(gè)新的參數(shù) G ( 表二 ) 很好的反映出這類數(shù)據(jù)的特征。五參數(shù)擬合的通用公式為：y =((A-D) / (1 + ((x/C)^B)) ^G) + D。不對(duì)稱參數(shù) G 可以使曲線的兩部分不一致。但是需要說(shuō)明的是，當(dāng) G 值很小或者需要平行線(PLA) 分析時(shí)，建議使用四參數(shù)擬合方式來(lái)獲得更好的擬合效果。

選擇最佳的曲線擬合方式

曲線擬合后的好壞，尤其是標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，需要使用精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)于獲取好的曲線擬合是十分重要的，而單次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)性會(huì)使曲線擬合的效果很差。R² 值是用來(lái)評(píng)估曲線擬合好壞的一個(gè)很好的指標(biāo)。通常來(lái)說(shuō)，當(dāng) R² 值大于 0.99 時(shí)，曲線擬合效果被認(rèn)為是很好的。但是當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差隨著樣品的濃度變化而變化時(shí)，R² 值出現(xiàn)偏差而不準(zhǔn)確。理想的情況是標(biāo)準(zhǔn)偏差在所有濃度樣品下都應(yīng)該一致，適用于方差一致性的數(shù)據(jù)；但是不是所有的情況都是標(biāo)準(zhǔn)偏差隨著樣品的濃度增加而增加，這時(shí) R² 的就不適用了，需要新的方法衡量。

使用赤池信息量準(zhǔn)則 (AIC) 和 F 分布下的統(tǒng)計(jì)量方法進(jìn)行的誤差平方和 (SSE) 被用來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化這些異方差數(shù)據(jù)。這兩種方法在衡量測(cè)定值和選擇的擬合曲線的理論值之間的誤差時(shí)是十分相似的方法。由于 SSE方法需要使用殘差和殘差圖，因此該方法又稱為殘差平方和法。殘差的定義是指在每個(gè)選定濃度下，實(shí)際的響應(yīng)值y和所選擬合曲線所得的理論響應(yīng)值 y′ 的差異性，即殘差 = 測(cè)定數(shù)據(jù)-擬合數(shù)據(jù) = y - y′。殘差代表的是隨機(jī)偏差。因此，當(dāng)曲線擬合方式符合數(shù)據(jù)時(shí)，殘差圖中點(diǎn)的分布應(yīng)該是圍繞 y = 0 軸的隨機(jī)點(diǎn) ( 圖表 3A )。如果殘差圖中點(diǎn)的分布情況是有規(guī)律的 ( 圖表3B )， 那么很明顯該數(shù)據(jù)的曲線擬合方式是很差的。

SSE 方法使用下面的公式進(jìn)行分析：SSE= Σ wi (yi - yi)²。假設(shè)數(shù)據(jù)誤差是不相關(guān)的且符合正態(tài)分布，使 SSE 盡可能的最小能夠最大近似的估算數(shù)據(jù)模型的曲線公式參數(shù)。換句話說(shuō)，最佳的曲線擬合方式是其參數(shù)能夠得到最小的 SSE。如果兩種擬合方式都能符合數(shù)據(jù)，那么哪個(gè)殘差圖給出了最小的 SSE，就使用那個(gè)擬合。

當(dāng)兩種擬合方式是嵌套關(guān)系及一種是另一種的特殊情況時(shí)，例如四參數(shù)擬合就是五參數(shù)擬合當(dāng) G = 1 時(shí)的特殊情況，具有更多參數(shù)的擬合方式要比另一個(gè)更能得到最小的 SSE。這是因?yàn)楦�多的參�?shù)能夠使曲線擁有更多的拐點(diǎn)來(lái)匹配數(shù)據(jù)。因此，需要引入一些額外的統(tǒng)計(jì)計(jì)算來(lái)決定哪種擬合方式是最匹配數(shù)據(jù)的，這個(gè)統(tǒng)計(jì)計(jì)算有F-test 和 F-probability。F probability是使用 F-test 和擬合曲線模型的自由度來(lái)評(píng)估 SSE 的減小是否是偶然發(fā)生的。一般的，當(dāng) probability 值小于 0.05 時(shí)，說(shuō)明該擬合曲線的公式最匹配數(shù)據(jù)。

AIC 方法是用類似的統(tǒng)計(jì)計(jì)算來(lái)比較兩個(gè)具有嵌套關(guān)系的曲線擬合方式那個(gè)更匹配所給的數(shù)據(jù)。AIC 值能夠通過(guò)下面的公式來(lái)計(jì)算，適用具有正態(tài)分布誤差的數(shù)據(jù)：AIC = n* log (SSE/n) + 2K。這里 n 代表樣本量，K 是描述曲線的參數(shù)數(shù)量。當(dāng)樣本量小時(shí) (n /K < ~40)，則使用二階的AIC 值 (AICc)，公式為 AICc = AIC + 2K*(K + 1) / (n - K - 1)，這里 n 代表樣本量，K是描述曲線的參數(shù)數(shù)量。當(dāng)樣本量增加時(shí)，AICc = AIC + 2K* (K + 1) / (n - K - 1) 公式末項(xiàng)值趨近于零，這時(shí) AICc = AIC。AICc和 AIC 都用來(lái)評(píng)估最佳的擬合方式和公式擬合公式具有多少參數(shù)能夠達(dá)到特定的匹配程度。AIC 方法限制了公式參數(shù)的數(shù)量，因此得到最佳的擬合方式卻使參數(shù)最小化了。較低 AIC 值的曲線擬合通常是首選的擬合方式，即一個(gè)最少參數(shù)的曲線擬合公式依然能夠是最佳的擬合方式。

上述兩種方法都可以用來(lái)決定哪種曲線擬合方式最匹配數(shù)據(jù)，但是這兩種方法均不能作為零假設(shè)檢測(cè)的測(cè)試模型。如果很難找到最佳匹配的擬合方式，邏輯上選擇最接近的擬合擬合。例如一個(gè)無(wú)限宇宙的模型，曲線擬合僅能夠找到最佳參數(shù)的已知模型或者比較兩個(gè)擬合方式哪個(gè)更好，但是適合無(wú)限宇宙模型的候選公式需要基于調(diào)查和科學(xué)的驗(yàn)證。在指定了一組合理的模型來(lái)解釋數(shù)據(jù)之后，在分析之前需要評(píng)估全局模型的擬合應(yīng)為最復(fù)雜的模型設(shè)置。假設(shè)全局模型匹配的話，那么認(rèn)為簡(jiǎn)單模型也同樣是匹配的，因?yàn)楹?jiǎn)單模型包含在全局模型中。

最佳擬合程度的衡量

SoftMax Pro7 能夠使用一個(gè)新的獨(dú)立的參數(shù)來(lái)衡量給的曲線是否匹配數(shù)據(jù)。參數(shù)依賴性是測(cè)量當(dāng)一個(gè)參數(shù)到達(dá)最佳時(shí)另一個(gè)參數(shù)的最佳的限度和范圍。一個(gè)具有 2 個(gè)或更多參數(shù)的擬合方式，描述曲線的參數(shù)即可能是關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)的，又可能是贅余的。如果在曲線擬合完成后改變曲線的一個(gè)參數(shù)，那么新的曲線應(yīng)該是遠(yuǎn)離數(shù)據(jù)點(diǎn)的。在此時(shí)，如果改變另一個(gè)參數(shù)的值能夠補(bǔ)償固定參數(shù)并使曲線向數(shù)據(jù)點(diǎn)靠近，但是和原始曲線設(shè)置不同，那么這些參數(shù)是關(guān)聯(lián)性。相反地，如果曲線回到了原始的位置，那么這些參數(shù)是贅余的。參數(shù)的獨(dú)立性用 0~1 的數(shù)值進(jìn)行衡量，當(dāng)數(shù)值為1 時(shí)參數(shù)完全獨(dú)立。要在圖形中顯示該獨(dú)立性質(zhì)時(shí)，請(qǐng)點(diǎn)擊如圖四的曲線擬合設(shè)置圖標(biāo)圖四。將會(huì)彈出曲線擬合設(shè)置窗口，只要選擇Statistics欄并勾選“Calculateparameter dependencies”即可。

在圖形表格中將會(huì)顯示出每一個(gè)參數(shù)的獨(dú)立性質(zhì) ( 圖五 )。在圖五中，參數(shù)的獨(dú)立程度使用對(duì)數(shù)標(biāo)度的 bar 顯示出來(lái)。十格bar 表明參數(shù)的獨(dú)立程度很高。由于只有很小的值才會(huì)影響擬合結(jié)果，因此這種標(biāo)度采用非線性的標(biāo)度方式。如果多個(gè)參數(shù)bar 很小或沒(méi)有的話，表明該擬合方式對(duì)數(shù)據(jù)是不匹配的。例如，如果數(shù)據(jù)是具有很明顯上限和下限漸近線的 S 型曲線，那么一個(gè)四參數(shù)擬合將適用于該數(shù)據(jù)，所有參數(shù)應(yīng)該都具有很高的 bar 值。但是如果一條或兩條漸近線都沒(méi)有的話，則參數(shù) A和 D 的 bar 值將會(huì)很小，表明不能從數(shù)據(jù)中推導(dǎo)出可靠的參數(shù)值。

新的標(biāo)準(zhǔn)：曲線擬合評(píng)估

在 Softmax Pro 軟件中設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)模板，曲線擬合評(píng)估，用來(lái)在分析數(shù)據(jù)時(shí)自動(dòng)的計(jì)算SSE，F(xiàn) probability 和 AIC 值。在結(jié)果顯示窗口中展示出使用 SSE 和 AIC 方法進(jìn)行的曲線擬合分析相關(guān)的所有計(jì)算 ( 圖七 )。標(biāo)準(zhǔn)模板均可以在 網(wǎng)站中下載。在下面這個(gè)例子中，所要分析的數(shù)據(jù)使用四參數(shù) ( 圖 6A ) 和五參數(shù) ( 圖 6B ) 分別進(jìn)行擬合，兩種擬合方式均得到 R² = 1。

所有的計(jì)算結(jié)果均在圖七中羅列出來(lái)。SSE 方法顯示五參數(shù)擬合比四參數(shù)擬合方式更匹配這些數(shù)據(jù)，因?yàn)槲鍏��?shù)的 SSE =0.027 而四參數(shù)的 SSE = 0.058。問(wèn)題是四參數(shù)擬合是五參數(shù)擬合的當(dāng) G = 1 時(shí)的特殊情況，四參數(shù)應(yīng)該和五參數(shù)一樣的適合于這類數(shù)據(jù)。因此需要使用額外的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步分析。F test (61.538) 和 F probability (0.000) 進(jìn)一步確認(rèn)了五參數(shù)擬合方式更匹配所分析的數(shù)據(jù)。AIC 方法也表明五參數(shù)擬合更適合所分析的數(shù)據(jù)，其中四參數(shù) AIC = -405.365 而五參數(shù) AIC =-447.945。最終殘差圖顯示兩種擬合方式都是數(shù)據(jù)點(diǎn)隨機(jī)分布在 X 軸附近，說(shuō)明兩種擬合方式均適合于該數(shù)據(jù) ( 圖八 )。綜合評(píng)估，所分析的數(shù)據(jù)最佳的擬合方式應(yīng)選擇五參數(shù)擬合。

總結(jié)

在 SoftMax Pro7 中含有多種數(shù)學(xué)模型可供使用，包括常用的四參數(shù)和五參數(shù)擬合方式。R² 值可以粗略的衡量曲線擬合是否匹配所要分析的數(shù)據(jù)，特別是異方差類的數(shù)據(jù)。SSE 和 AIC 方法被用來(lái)評(píng)估曲線擬合的匹配程度已選擇可能最好的曲線擬合方式。然而在此之前，首先要明確的是兩種擬合數(shù)據(jù)的方式都必須是合理的和符合科學(xué)理性的。SoftMax Pro7 還包含一種方法，用來(lái)計(jì)算參數(shù)的獨(dú)立性，以此評(píng)估曲線擬合方式對(duì)數(shù)據(jù)的匹配程度。參數(shù)獨(dú)立性的結(jié)果能夠直觀的展示到圖標(biāo)中幫助你解讀您的數(shù)據(jù)。