簡(jiǎn)介

用熒光方法定量細(xì)胞增殖可以簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)藥物或其他實(shí)驗(yàn)處理方法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Life Technologies公司的CyQUANT細(xì)胞增殖試劑盒是一個(gè)敏感性高、可重復(fù)并且簡(jiǎn)便的做熒光微孔板檢測(cè)的方法。CyQUANT的GR染料可標(biāo)記到細(xì)胞核上，通過(guò)熒光來(lái)計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)。DNA與RNA的比例會(huì)隨著細(xì)胞周期的變化而改變，因此，CyQUANT試劑盒可以通過(guò)RNA酶溶解產(chǎn)物和核酸量做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

本應(yīng)用介紹了如何應(yīng)用CyQUANT試劑盒和Molecular Devices公司的SpectraMax微孔板檢測(cè)系統(tǒng)及SoftMax® Pro軟件檢測(cè)細(xì)胞增殖。文中共介紹了兩種方法，一種是基于細(xì)胞的方法，另一種是將細(xì)胞樣品用RNA酶溶解后做DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

優(yōu)勢(shì)

- Rapid and convenient quantitation of cell growth
- Sensitive detection of as few as 50 cells
- Easy data analysis with preconfigured SoftMax Pro Software protocol

材料

- CyQUANT 細(xì)胞增殖試劑盒 (Life Technologies cat. # C7026)：Component A，400X CyQUANT GR 染料； component B，20X細(xì)胞溶解液； component ，100 μL濃度為 100 μg/mL的λ DNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液
注意： 細(xì)胞溶解液和染料稀釋后需在幾小時(shí)內(nèi)使用，CyQUANT GR染料溶液需避光保存。
- 細(xì)胞系： CHO-K1 細(xì)胞(ATCC # CCL-61)
- EDTA溶液(Fisher Chemicals cat. # S311-100)
- NaCl 溶液(Fisher Chemicals cat. # S271-500)
- 無(wú)DNA酶的RNA酶A或RNA酶混合液(Ambion cat. # 2286)
- 黑色底透96孔板(Corning cat. # 3603)
- 具有熒光檢測(cè)模塊的SpectraMax微孔板讀板機(jī) (Molecular Devices)

細(xì)胞準(zhǔn)備

CyQUANT實(shí)驗(yàn)的貼壁或不貼壁細(xì)胞可以直接在微孔板中培養(yǎng)細(xì)胞然后冷凍，或者在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，然后冷凍細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移動(dòng)微孔板中。詳細(xì)步驟可參考CyQUANT細(xì)胞增殖試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)MP-7026。

基于細(xì)胞的CyQUANT實(shí)驗(yàn)法

準(zhǔn)備細(xì)胞

步驟1：用胰酶或EDTA溶液將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，用培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液按表中濃度稀釋后放入96孔板，對(duì)照組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。
步驟2：將孔板置于37℃環(huán)境下直到檢測(cè)增殖的時(shí)間。孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類(lèi)型、增殖檢測(cè)類(lèi)型及實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?BR>步驟3：吸出孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗一次，若細(xì)胞貼壁不牢可不洗。
步驟4：將孔板置于-70℃冷凍細(xì)胞直到檢測(cè)(至少一小時(shí)，長(zhǎng)可達(dá)數(shù)周)。冷凍步驟有利于細(xì)胞樣品的完全裂解。

制備細(xì)胞樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

注意：最好使用與實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同類(lèi)型的細(xì)胞類(lèi)型。

步驟1：用胰酶或EDTA溶液將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，用培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至105-106cells/mL。
步驟2：取1mL細(xì)胞懸液200g(約1,500rpm)離心5分鐘，棄掉上清，將管底離出細(xì)胞置于-70℃冷凍直到檢測(cè)。冷凍步驟有利于細(xì)胞樣品的完全裂解。

準(zhǔn)備試劑

步驟1：制備1X細(xì)胞裂解液，用蒸餾水以1:20稀釋細(xì)胞裂解液儲(chǔ)存液，需制備每孔200μL。
步驟2：制備1X CyQUANT GR染液/細(xì)胞裂解液，用1X細(xì)胞裂解液以1:400稀釋CyQUANT GR染液儲(chǔ)存液。稀釋液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。

制備基于細(xì)胞法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品

步驟1：將之前冷凍的離出細(xì)胞放在室溫幾分鐘解凍。加入1mLCyQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液，渦旋使細(xì)胞重懸。假設(shè)細(xì)胞為106個(gè)，細(xì)胞裂解液相當(dāng)于106cells/mL。
步驟2：在孔板中以1:2的稀釋梯度放入細(xì)胞懸液，最高為50,000cells/mL，最低為24cells/mL。加入CyQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液使每孔液體終體積為200μl。每個(gè)濃度四個(gè)重復(fù)，并在空余孔中設(shè)幾個(gè)對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞)。
步驟3：將微孔板避光放置于室溫2-5分鐘。

設(shè)置儀器和軟件參數(shù)

步驟1：打開(kāi)微孔板讀板儀開(kāi)關(guān)，打開(kāi)SoftMaxPro軟件并點(diǎn)擊ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夾中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步驟2：按表中所示參數(shù)設(shè)置儀器，此設(shè)置已在預(yù)配置的列表中。
步驟3：使用TemplateEditor設(shè)置孔板加樣的模板，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品孔(每孔的細(xì)胞數(shù))、空白對(duì)照孔(無(wú)細(xì)胞)和樣品孔的位置。模板設(shè)置的列子如圖1所示。注意，同時(shí)點(diǎn)擊Ctrl和Shift鍵將顯示每個(gè)孔的設(shè)置值，樣品的名字(Un01-Un02)沒(méi)有出現(xiàn)在所示圖中。
步驟4：將微孔板放于讀板機(jī)中，如果您的讀板機(jī)頂讀法需要放置適配器(如SpectraMaxM5)，請(qǐng)先放置適配器后再放入樣品。
步驟5：點(diǎn)擊軟件的Read鍵，儀器將對(duì)微孔板進(jìn)行讀值，相關(guān)的熒光值(RFUs)將出現(xiàn)在軟件的孔板位置。

數(shù)據(jù)分析

步驟1：如果設(shè)置了模板，微孔板讀值后，在Grouptable里將會(huì)自動(dòng)出現(xiàn)計(jì)算后的結(jié)果。
步驟2：TemplateEditor里設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)組的話(huà)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將會(huì)有軟件自動(dòng)生成。在CurveFit下拉菜單里可以選擇擬合曲線(xiàn)公式，本應(yīng)用說(shuō)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)選擇的是log-log曲線(xiàn)擬合(圖2)。也可以用quadratic曲線(xiàn)。
步驟3：計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)。軟件通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式計(jì)算出每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，并顯示在Unknownsgroup部分。

基于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果

基于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如前文所述，呈現(xiàn)在圖2中。在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)采用了log-log擬合算法，圖中所示結(jié)果是SpectraMaxM5微孔板讀板機(jī)得到的，MolecularDevices公司的其他具有熒光功能的讀板機(jī)均可得到相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

表3為表1中所列出的CHO-K1細(xì)胞樣品培養(yǎng)兩天的增殖數(shù)據(jù)結(jié)果，培養(yǎng)第二天的細(xì)胞增殖結(jié)果由SoftMaxPro軟件用基于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出。

RNA酶處理、基于DNA含量做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的CyQUANT實(shí)驗(yàn)法

細(xì)胞增殖同樣可以用DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)細(xì)胞曲線(xiàn)可計(jì)算出DNA含量，細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)RNA酶處理就排除了RNA對(duì)結(jié)果的干擾。在本應(yīng)用說(shuō)明中，列出了用DNA含量做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量細(xì)胞樣品的設(shè)置步驟。

準(zhǔn)備試劑

步驟1：制備1X細(xì)胞裂解液，用蒸餾水以1:20稀釋細(xì)胞裂解液儲(chǔ)存液，需制備每孔200μL。一部分細(xì)胞裂解液加入1mMEDTA和180mMNaCl，一部分不加EDTA和NaCl。
步驟2：制備1X和2XCyQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液，用1X細(xì)胞裂解液以1:400或1:200稀釋CyQUANTGR染液儲(chǔ)存液。稀釋液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。

在塑料管中制備DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品

步驟1：用1X細(xì)胞裂解液稀釋試劑盒中100μg/mLDNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，稀釋成1μg/mL存儲(chǔ)液。
步驟2：將DNA存儲(chǔ)液按表4所列按梯度稀釋。
注意：CyQUANT試劑盒中的是λ噬菌體DNA，本文中的數(shù)據(jù)都是按標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋。對(duì)于自己的實(shí)驗(yàn)也可選擇其他來(lái)源的DNA樣品，具體操作請(qǐng)參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)MP-7026。

準(zhǔn)備細(xì)胞

依據(jù)所用的細(xì)胞系(貼壁還是不貼壁)，按照Life Technologies的CyQUANT說(shuō)明書(shū)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)(微孔板中還是培養(yǎng)皿中)和凍存方法，在-70℃凍存細(xì)胞。本文中，貼壁細(xì)胞要先從培養(yǎng)皿中消化下來(lái)，然后離心，并將離心得到的細(xì)胞斑塊凍存。

準(zhǔn)備細(xì)胞樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)DNA樣品和空白

步驟1：將之前冷凍的離出細(xì)胞放在室溫幾分鐘解凍。加入1mLCyQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液，渦旋使細(xì)胞重懸。
步驟2：預(yù)處理細(xì)胞，每孔中加入含1mMEDTA和180mMNaCl的細(xì)胞裂解液，并在4個(gè)沒(méi)有細(xì)胞的孔中加入同樣的細(xì)胞裂解液(空白對(duì)照孔)。如果樣品為之前冷凍的細(xì)胞離心斑塊，先用100μL裂解液重懸，然后轉(zhuǎn)移到微孔板中。在有細(xì)胞的樣品孔和空白對(duì)照孔中分別加入4μLRNA酶(每孔兩個(gè)單位，詳見(jiàn)下文)。室溫孵育1小時(shí)。
注意：無(wú)DNA酶的RNA酶處理細(xì)胞時(shí)濃度不超過(guò)10μL中含有飽和活性單位。例如，試劑盒中混合RNA酶濃度為500U/mL，所以每4μL中含有兩個(gè)活性單位。
步驟3：在有細(xì)胞的樣品孔和空白對(duì)照孔中分別加入100μL2XCyQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液。
步驟4：將之前準(zhǔn)備的DNA梯度稀釋液依次加入到微孔板中，孔板中因包含兩種對(duì)照，一種是加入稀釋液但無(wú)DNA的空白對(duì)照，另一種是只含有1XCyQUANTGR染液/細(xì)胞裂解液的孔板空白對(duì)照(無(wú)DNA和RNA酶)。
步驟5：室溫孵育2-5分鐘

設(shè)置儀器和軟件參數(shù)

步驟1：打開(kāi)微孔板讀板儀開(kāi)關(guān)，打開(kāi)SoftMaxPro軟件并點(diǎn)擊ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夾中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步驟2：按表2中所示參數(shù)設(shè)置儀器，此設(shè)置已在預(yù)配置的列表中。
步驟3：使用TemplateEditor設(shè)置孔板加樣的模板，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品孔、孔板空白對(duì)照孔和樣品孔(RNA酶處理的細(xì)胞)的位置。

讀板和數(shù)據(jù)分析

步驟1：將微孔板放于讀板機(jī)中。
步驟2：點(diǎn)擊軟件的Read鍵。
步驟3：儀器將對(duì)微孔板進(jìn)行讀值后，相關(guān)的熒光值(RFUs)將出現(xiàn)在軟件的孔板位置，數(shù)據(jù)將依據(jù)設(shè)置分析出結(jié)果，并顯示在Grouptables中。
步驟4：TemplateEditor里設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)組的話(huà)，DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將會(huì)有軟件自動(dòng)生成。
步驟5：在CurveFit下拉菜單里可以選擇擬合曲線(xiàn)公式，本應(yīng)用說(shuō)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)選擇的是log-log曲線(xiàn)擬合。
步驟6：軟件通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式計(jì)算出每個(gè)DNA樣品的濃度，并顯示在Unknownsgroup部分。

DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果

基于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如前文所述，呈現(xiàn)在圖3中。在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)采用了log-log擬合算法，圖中所示結(jié)果是SpectraMaxM5微孔板讀板機(jī)得到的，MolecularDevices公司的其他具有熒光功能的讀板機(jī)均可得到相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。用RNA酶處理細(xì)胞檢測(cè)DNA含量做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的例子現(xiàn)實(shí)在表5中。在此應(yīng)用說(shuō)明中，一個(gè)系列的細(xì)胞濃度被計(jì)算。事實(shí)上，每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)在50-50,000個(gè)之間(標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi))均可用此方法計(jì)算得到細(xì)胞DNA濃度。

圖4顯示橫坐標(biāo)為每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)，縱坐標(biāo)為平均DNA含量，曲線(xiàn)范圍為50-50,000個(gè)細(xì)胞，結(jié)果如試劑盒說(shuō)明書(shū)所述。圖5中顯示了RNA酶處理的和未處理的細(xì)胞樣品RFUs值的比較，說(shuō)明RNA酶處理會(huì)降低細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度。

總結(jié)

CyQUANT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是快速的、靈敏的檢測(cè)細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞DNA含量的熒光方法。SpectraMax M5微孔板讀板機(jī)得到的數(shù)據(jù)結(jié)果與Molecular Devices公司的其他具有熒光功能的讀板機(jī)得到的結(jié)果相似�；�于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和5分鐘的孵育，我們得到了與CyQUANT試劑盒相似的動(dòng)態(tài)范圍(50-50,000個(gè)細(xì)胞)。應(yīng)用λ DNA樣品得到的曲線(xiàn)及通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算DNA含量的下限位50個(gè)細(xì)胞。結(jié)合應(yīng)用SoftMaxPro的軟件分析功能及預(yù)置的CyQUANT拍攝設(shè)置，提供了一個(gè)計(jì)算和得到數(shù)據(jù)便捷的方法。

參考文獻(xiàn)

1. Life Technologies Product InformationsheetMP 7026 1/12/01: CyQUANT CellProliferation Assay Kit (C-7026).