膀胱癌（Bladder cancer）是一種常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，由于易轉(zhuǎn)移，死亡率高，5年生存率只有8.1%。因此，研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，有助于對(duì)膀胱癌的診斷和治療。circRNA是一類具有閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，是現(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的新星。本研究從circRNA的角度出發(fā)，深入闡述了一個(gè)circRNA在膀胱癌中的作用機(jī)制。

1. 膀胱癌特異性circRNA的篩選與鑒定

為篩選和膀胱癌特異性相關(guān)的circRNA，研究人員對(duì)3對(duì)配對(duì)癌組織和正常膀胱組織進(jìn)行了circRNA特異性的高通量測(cè)序（伯豪生物參與），共鑒定到16,353個(gè)circRNA。其中，有88.35.%的circRNA來源于exons，有524個(gè)在癌組織中下調(diào)，47個(gè)上調(diào)。

接下來，研究人員在膀胱癌細(xì)胞系（T24T和UMUC3）中進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circHIPK3穩(wěn)定地在兩種細(xì)胞系中表達(dá)。進(jìn)一步的分析和大樣本鑒定表明，circHIPK3在79.5%的膀胱癌組織中特異性降低，并與grade, invasion和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。FISH實(shí)驗(yàn)表明，circHIPK3主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2. circHIPK3抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為探究circHIPK3的生物學(xué)功能，研究人員在兩個(gè)細(xì)胞系中過表達(dá)circHIPK3，進(jìn)行細(xì)胞表型檢測(cè)。結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移和侵襲受到抑制。當(dāng)siRNA敲降circHIPK3時(shí)，細(xì)胞遷移和侵襲增強(qiáng)。因此，circHIPK3在膀胱癌細(xì)胞中影響了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3. circHIPK3在膀胱癌細(xì)胞中大量吸附miR-558

在第一篇circHIPK3的研究中，其就是通過miRNA sponge方式發(fā)揮功能。那么，在膀胱癌中，是否也是ceRNA方式呢？通過miRanda，PITA和RNAhybrid預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有12個(gè)miRNA能與之結(jié)合。Pull down實(shí)驗(yàn)表明，miR-558能在T24T和UMUC3中與circHIPK3結(jié)合。進(jìn)一步的突變實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了兩者的結(jié)合關(guān)系，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了兩者在細(xì)胞質(zhì)中的共定位。因此，circHIPK3能直接結(jié)合miR-558。

4. miR-558通過靶向HPSE影響膀胱癌細(xì)胞的遷移，侵襲和血管生成

先前的研究表明，miR-558在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中通過促進(jìn)HPSE的轉(zhuǎn)錄，而影響遷移，侵襲和血管生成，而HPSE又在膀胱癌中高表達(dá)。因此，研究人員在膀胱癌組織和細(xì)胞系中對(duì)miR-558進(jìn)行了驗(yàn)證，確實(shí)發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。然后，通過過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲增強(qiáng)。而抑制miR-558表達(dá)時(shí)，出現(xiàn)了相反的細(xì)胞表型。RT-PCR和Weston blot實(shí)驗(yàn)表明，HPSE，VEGF，MMP-9表達(dá)在過表達(dá)時(shí)增強(qiáng)，抑制表達(dá)時(shí)減弱。因此，miR-558通過靶向HPSE影響膀胱癌細(xì)胞的遷移，侵襲和血管生成。

5. 過表達(dá)circHIPK3逆轉(zhuǎn)miR-558對(duì)細(xì)胞的影響

circHIPK3和miR-558的結(jié)合關(guān)系搞清楚了，兩者的生物學(xué)功能也是一致的，那么他們是不是通過這種關(guān)系在同一條路上起作用呢？結(jié)果顯示，過表達(dá)circHIPK3，HPSE，VEGF，MMP-9表達(dá)顯著降低，而當(dāng)敲降circHIPK3時(shí)，都顯著上調(diào)。那么是否是通過結(jié)合miR-558發(fā)揮功能呢？把miR-558 mimic和過表達(dá)circHIPK3共轉(zhuǎn)染，可以發(fā)現(xiàn)HPSE，VEGF，MMP-9表達(dá)顯著降低了，遷移和侵襲也降低。因此，circHIPK3確實(shí)是通過吸附miR-558，調(diào)控了HPSE的轉(zhuǎn)錄來影響細(xì)胞的遷移，侵襲和血管生成。

6. 小鼠模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circHIPK3的生物學(xué)功能

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了功能，在體內(nèi)是否work，這是一個(gè)問號(hào)。因此，研究人員將轉(zhuǎn)染circHIPK3的T24T細(xì)胞移植到裸鼠中。結(jié)果顯示，腫瘤的生長(zhǎng)速率和質(zhì)量比對(duì)照低。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，HPSE，VEGF，MMP-9表達(dá)受到抑制，CD31+，平均血管密度減少。另外，轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)也明顯顯示，過表達(dá)circHIPK3的小鼠肺轉(zhuǎn)移能力減弱。因此，小鼠實(shí)驗(yàn)也有效地驗(yàn)證了circHIPK3對(duì)膀胱癌生長(zhǎng)，血管生成和轉(zhuǎn)移的影響。

研究結(jié)論

本研究通過高通量篩選，體內(nèi)體外的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，報(bào)道了一個(gè)已經(jīng)有研究的circRNA在膀胱癌中的生物學(xué)功能。當(dāng)然，在膀胱癌中，circHIPK3是第一次報(bào)道，也是通過了吸附和之前報(bào)道的不同的miRNA發(fā)揮功能。因此，做circRNA研究，無論是有過研究，還是沒有研究過的，只要能把機(jī)制說清楚了，功能說明白了，都能在比較好的雜志上發(fā)表。

原文出處：Li Y, Zheng F, Xiao X, Xie F, Tao D, Huang C, Liu D, Wang M, Wang L, Zeng F, Jiang G. CircHIPK3 sponges miR-558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells. EMBO reports.2017.