烏司他丁對異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙的影響
【摘要】 目的 評價烏司他丁預(yù)先給藥對異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙的影響。方法 健康雄性SPF 級 C57BL /6 小鼠 36 只,18 月齡,體重 27 ~ 35 g,采用隨機數(shù)字表法,將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對照組 ( C組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預(yù)先給藥組( S 組) 。I 組和 S 組暴露于 1% 異氟醚 3 h,連續(xù) 7 d; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。末次暴露結(jié)束后 24 h 進行認知功能測試,包括 Morris 水迷宮和曠場實驗測試,測試完畢后立即處死小鼠取海馬,采用 ELISA 法測定白細胞介素 - 6( IL - 6) 、白細胞介素 - 1β( IL - 1β)和腫瘤壞死因子 - α( TNF - α) 含量。結(jié)果 與 C 組比較,I 組逃避潛伏期延長,原平臺停留時間和穿越平臺次數(shù)減少,曠場中心區(qū)停留時間縮短,海馬 IL - 1β、TNF- α 含量升高( P < 0. 05) ,S 組上述指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P > 0. 05) 。與 I 組比較,S 組逃避潛伏期明顯縮短,原平臺停留時間和穿越原平臺次數(shù)增多,曠場中心區(qū)停留時間延長,海馬 IL - 1β、TNF - α 含量降低( P < 0. 05) 。結(jié)論 烏司他丁預(yù)先給藥可改善異氟醚暴露所致老年小鼠認知功能障礙,其機制可能與抑制海馬炎癥因子過度釋放有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 異氟醚; 烏司他丁; 老年鼠; 認知障礙; 海馬; 炎癥
術(shù)后認知障礙( POCD) 是老年患者術(shù)后常見的并發(fā)癥之一。研究表明,異氟醚可導(dǎo)致 POCD。因此探尋有效措施預(yù)防和治療異氟醚導(dǎo)致的認知功能障礙具有重要意義。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑,可減少炎癥介質(zhì)的過度釋放。研究表明,烏司他丁具有神經(jīng)保護作用,但其能否有效地防治異氟醚所致認知功能障礙尚不明確。本研究擬評價烏司他丁預(yù)先給藥對異氟醚暴露致認知功能障礙的影響。
1 材料與方法
1. 1 實驗動物 健康雄性 SPF 級 C57BL /6 小鼠 36只,18 月齡,雄性,體重 27 ~ 35 g,由中山大學(xué)實驗動物中心提供,于室內(nèi)溫度 22℃ ,濕度 50% ,12 h/12 h 晝夜明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法,將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對照組( C 組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預(yù)先給藥組( S 組) 。
1. 2 方法 參照文獻[4]的方法并加以改進,將小鼠置于密閉麻醉箱中,頂蓋一小孔與氣體監(jiān)測儀的導(dǎo)管相通,持續(xù)監(jiān)測箱內(nèi)異氟醚、CO2和 O2的濃度。麻醉箱底部浸于 37℃ 的恒溫水浴箱中。I 組和 S 組暴露于1% 異氟醚( 批號: 936245U,Abbott 公司,美國) 3 h,異氟醚以空氣( 21% 氧氣混合 79% 氮氣) 輸送,新鮮氣體流量 1. 5 L/min,連續(xù) 7 d; C 組吸入空氣 3 h; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。
1. 3 Morris 水迷宮實驗和曠場試驗(儀器均由上海欣軟信息科技有限公司提供) 末次暴露結(jié)束后 24 h 進行 Morris 水迷宮實驗和曠場試驗。在定位航行實驗中,記錄小鼠游泳速率和潛伏期。在定位航行試驗第 4 天完成之后行空間探索試驗。此時平臺從第Ⅰ象限移除。小鼠從定位航行實驗平臺放置象限相對的象限即第Ⅲ象限入水,每次進入小鼠游泳 60 s 后停止。記錄目標象限穿越次數(shù)和目標象限停留時間。曠場試驗持續(xù) 3 d。從小鼠放置在中央格時計時,每次記錄 15 min。記錄中央?yún)^(qū)停留時間、周邊區(qū)停留時間、總路程及平均速率。
1. 4 白細胞介素 - 6 ( IL - 6 ) 、白細胞介素 - 1β( IL -1β) 和腫瘤壞死因子 - α( TNF - α) 含量測定 認知功能測試完畢后立即處死小鼠,剝離雙側(cè)海馬組織,存于- 80℃ 冰箱,采用 ELISA 法測定海馬 IL - 6、IL - 1β 和TNF - α 含量。稱重海馬,稀釋至 400 μL,按試劑盒說明書步驟操作,根據(jù)標準品的濃度以及相對應(yīng)的吸光值( OD450值) 通過 Curve Expert1. 3 軟件分析作出標準曲線圖,根據(jù)酶標儀檢測得到樣品的,利用標準曲線的方程式計算海馬 IL - 6、IL - 1β 和 TNF - α 含量。
1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 16. 0 統(tǒng)計軟件,計量資料組間比較采用成組 t 檢驗。
3 討論
探討圍手術(shù)期 POCD 發(fā)生的原因,以及避免和防范 POCD 成為亟待解決的問題。18 月齡的 C5 /7 小鼠相當于人類中老年期,因此本研究選用 18 月齡鼠作為研究對象,以期了解異氟醚對老年鼠學(xué)習記憶的損害。根據(jù) RAMMES 的研 究,小 鼠 異 氟 醚 MAC 值 在( 1. 33 ± 0. 16) % ,因此本研究采用 1% 異氟醚濃度 3 h麻醉暴露方案。
Morris 水迷宮是應(yīng)用于腦學(xué)習記憶機制研究的一種實驗手段,在學(xué)習記憶﹑新藥研發(fā)﹑海馬 /外海馬研究﹑藥理學(xué)﹑毒理學(xué)等應(yīng)用非常普遍。曠場試驗是一種經(jīng)典評價動物行為學(xué)的實驗?zāi)P,主要反映動物在新環(huán)境的自主行為和探究行為。本研究中 Morris 水迷宮結(jié)果和曠場試驗結(jié)果提示,I 組老年小鼠的學(xué)習記憶能力和空間探索能力均較對照組降低,而 S 組與 C 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明烏司他丁可減輕異氟醚暴露所致老年小鼠學(xué)習探索和記憶能力的損傷。
本研究結(jié)果表明,烏司他丁預(yù)先給藥可改善異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙,其機制可能與減少海馬炎性因子的過度釋放有關(guān)。神經(jīng)細胞炎性因子( IL - 1β、TNF - α 和 IL - 6 等) 釋放能夠?qū)е抡J知功能減退。炎性因子釋放可抑制海馬長時程增強,而海馬長時程增強是海馬學(xué)習記憶的關(guān)鍵。另外,IL - 1β能夠激活 Caspase - 3,從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,可通過IL - 1β / Caspase - 3 / 神經(jīng)凋亡途徑損害認知功能。而烏司他丁能調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng),抑制促炎性細胞因子的釋放、促進抗炎性細胞因子的釋放。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑,可有效抑制多種蛋白酶、糖苷酶、脂水解酶的活性。在膿毒癥、休克及心、肺、肝、腸的缺血再灌注損傷中,烏司他丁具有明顯的抑制炎癥因子釋放、保護組織臟器功能的作用。有研究表明在腦缺血再灌注模型的體內(nèi)外實驗中,烏司他丁能夠減少腦缺血再灌注損傷。另一項研究證實,在神經(jīng)病理性疼痛模型中,烏司他丁可抑制 IL - 1β、TNF - α 等炎癥因子釋放,拮抗炎性因子造成的慢性神經(jīng)病理性疼痛。本研究結(jié)果表明,與對照組比較,I 組海馬 IL - 1β 和 TNF - α 含量升高,提示異氟醚麻醉可促進老年小鼠海馬炎性反應(yīng),導(dǎo)致其認知功能降低。機制可能與異氟醚導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,激活 NF - κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進炎性反應(yīng)有關(guān)。而烏司他丁預(yù)先給藥組促炎性細胞因子IL - 1β、TNF - α 的濃度明顯降低,可明顯減輕與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)的神經(jīng)認知功能損傷。