越鞠丸醇提物對孕前應(yīng)激誘導(dǎo)的產(chǎn)后抑郁小鼠模型的快速抗抑郁作用

摘要 目的：以孕前應(yīng)激誘導(dǎo)建立產(chǎn)后抑郁（PPD）小鼠模型，觀察越鞠丸醇提物（YJ）對該模型的快速抗抑郁作用。方法：將40只 BALB/C雌鼠隨機(jī)分為２組，空白對照組不予任何刺激，孕前應(yīng)激組給予慢性束縛刺激。3周后孕前應(yīng)激組小鼠雌雄合籠交配懷孕，于分娩后３周檢測模型組母鼠行為學(xué)，包括蔗糖偏好測試（SPT）、強(qiáng)迫游泳測試（FST）、懸尾測試（TST）及陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)（NSFT）。造模成功后，將模型組隨機(jī)分為4組：模型組、越鞠丸醇提物組、氯胺酮組、氟西汀組。越鞠丸醇提物及氯胺酮為單次給藥，氟西汀為連續(xù)21ｄ給藥。結(jié)果：產(chǎn)后3周，與空白對照組相比，孕 前 應(yīng) 激 誘 導(dǎo) 的 產(chǎn) 后 抑 郁 組 模 型 母 鼠 在 糖 水 偏 好 測 試 中 的 蔗 糖 消耗 百 分 比 顯 著 降 低 （P<0.001），在強(qiáng)迫游泳測試和懸尾測試中絕望狀態(tài)不動時(shí)間顯著增加（P<0.01，P<0.01），在陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)中攝食潛伏時(shí)間明顯增加而單位時(shí)間攝食量顯著減少（P<0.01，P<0.01）。單次給予ＹＪ 和氯胺酮２4ｈ之后，模型組母鼠的糖水消耗百分比顯著增加（P<0.01），強(qiáng)迫游泳和懸尾測試的絕望不動時(shí)間明顯降低（P<0.01，P<0.01），陌生環(huán)境攝食測試中潛伏時(shí)間顯著縮短且單位時(shí)間攝食量明顯增加（P<0.01，P<0.01），而氟西汀組未顯示相同作用。結(jié)論：氟西汀連續(xù)給藥對于孕前應(yīng)激誘導(dǎo)的PPD模型小鼠無明顯治療作用，提示該模型可能屬于難治性抑郁模型；在此模型上，越鞠丸具有與西藥氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。

關(guān)鍵詞 產(chǎn)后抑郁；孕前應(yīng)激；越鞠丸；快速抗抑郁；氯胺酮

產(chǎn)后抑郁癥 （ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ�。洌澹穑颍澹螅螅椋铮�，PPD）是產(chǎn)褥期精神綜合征中最常見的一種類型，以分娩后出現(xiàn)情緒低落，精神抑郁為主要癥狀，臨床以沮喪、悲傷、哭泣、易煩躁、易激動，甚至出現(xiàn)幻覺，或有自殺及傷嬰等一系列表現(xiàn)。PPD 嚴(yán)重危害產(chǎn)婦及嬰兒身心健康，給家庭和社會也帶來嚴(yán)重影響。PPD被認(rèn)為是難治性抑郁。由于一線抗抑郁西藥的副作用及局限性，不能有效地治療 PPD，因此尋找快速安全有效且無明顯副作用的中藥變得迫切而實(shí)際。越鞠丸出自《丹溪心法》，功能行氣解郁，是治療抑郁癥的經(jīng)典方劑，臨床上常用于抑郁癥的治療。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸對多個(gè)品系的小鼠模型具有與氯胺酮相似的快速抗抑郁作用，但該作用未在 PPD 動物模型上得到證實(shí)。PPD 的產(chǎn)生與多種因素相關(guān)，既往的應(yīng)激性生活事件被認(rèn)為是 PPD 發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究探索以孕前應(yīng)激法構(gòu)建 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠 PPD模型，以越鞠丸醇提物干預(yù)，觀察越鞠丸對PPD模型小鼠的作用，以研究孕前應(yīng)激對 PPD 致病的影響并驗(yàn)證越鞠丸對PPD的快速抗抑郁作用。

1材料與方法

１．１實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康成年雌性BALB/C小鼠４０只，體質(zhì)量１８－２４ｇ，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號：２００７０００５８１３０３。適應(yīng)性飼養(yǎng) １ 周后用于實(shí)驗(yàn)。動物房室溫２５ ℃、濕度為４５％，明暗交替時(shí)間為１２ｈ，動物可以自由飲食進(jìn)水。

１．２越鞠丸醇提物（Ｙｕｅｊｕ　ｅｔｈａｎｏｌ�。澹�ｔｒａｃｔ，ＹＪ）制備實(shí)驗(yàn)用中藥材購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診，經(jīng)本校藥學(xué)院專家鑒定，為中國藥典收載品種。取蒼術(shù)、神曲、香附、梔子、川芎５種藥材粉碎，過１００目篩，按等分重量混合后浸泡在９５％乙醇中（６倍體積）４８ｈ，期間不停攪拌。靜置后取上清，同樣過程重復(fù)兩次，收集３次的上清液后過濾，減壓濃縮至無乙醇。加入Ｔｗｅｅｎ－８０作為乳化劑（終濃度為0.5％），配制為實(shí)驗(yàn)所需濃度－２０ ℃保存?zhèn)溆�。將濃縮后的ＹＪ 進(jìn)行高效液相色譜（ＨＰＬＣ）分析，按照實(shí)驗(yàn)室之前確立的方法檢驗(yàn)不同批次ＹＪ 的指紋圖譜及穩(wěn)定性，并對其主要成分定量分析以進(jìn)行質(zhì)控。

１．３實(shí)驗(yàn)試劑  鹽酸氯胺酮（ｋｅｔａｍｉｎｅ，Ｋｅｔ）注射液為福建古田制藥廠生產(chǎn)（批號：２０１４０３０１）。臨用前用生理鹽水配成３０ｍｇ／ｍｌ的藥液。鹽酸氟西汀（Ｆｌｕｏｘ－ｅｔｉｎｅ，Ｆｌｘ）為美國 Ｓｉｇｍａ公司 產(chǎn)品，根 據(jù) Ｄｕｌａｗａ方法以生理鹽水配成濃度１８ｍｇ／ｋｇ的藥液。

１．４實(shí)驗(yàn)方法

１．４．１　動物分組及模型的制備小鼠隨機(jī)分為２組：空白對照組（ｎ＝８）和孕前應(yīng)激組（ｎ＝３２），空白對照組不予任何應(yīng)激，孕前應(yīng)激組小鼠每天給予６ｈ束縛應(yīng)激刺激（１１∶００－１７∶００）。３周后將孕前應(yīng)激組以一雌一雄分籠交配飼養(yǎng)。大約４周后，母鼠分娩，被定義為 ＰＰＤ模型組（Ｍｏｄ）。

將模型組母鼠隨機(jī)分為 Ｍｏｄ組（ｎ＝８），ＹＪ 組（ｎ＝８），Ｋｅｔ組（ｎ＝８），Ｆｌｘ組（ｎ＝８）。Ｆｌｘ組自產(chǎn)后第１天始每日腹腔注射 Ｆｌｘ注射液每１０ｇ體重０．１ｍｌ（相當(dāng)于每克小鼠給予氟西汀０．０１８ｍｇ），持續(xù)２１ｄ。產(chǎn)后第２０天，根據(jù)薛文達(dá)等的研究結(jié)果，ＹＪ 組予ＹＪ 濃度１３．５ｇ／ｋｇ，以每１０ｇ體重０．１ ｍｌ灌 胃（相 當(dāng) 于 每 克 小 鼠 給 予 越 鞠 丸 生 藥０．０１３�。担纾�，Ｋｅｔ組予 Ｋｅｔ注射液每１０ｇ體重０．１ｍｌ腹腔注射（相當(dāng)于每克小鼠給予氯胺酮０．０３ｍｇ），２４ｈ后，檢測各組母鼠的一系列行為學(xué)表現(xiàn)。

１．４．２　小鼠的行為學(xué)測試指標(biāo)

１．４．２．１　蔗糖偏好試驗(yàn) （ｓｕｃｒｏｓｅ�。穑颍澹妫澹颍澹睿悖濉。簦澹螅簦�ＳＰＴ）根據(jù) Ｄｕｌａｗａ方法改進(jìn)，在應(yīng)激之前，對應(yīng)激組和空白對照組予兩瓶２％蔗糖溶液適應(yīng)３ｄ。禁水禁食１８ｈ后，小鼠單籠飼養(yǎng)，每籠給予一瓶２％蔗糖溶液和一瓶自來水，觀察 ２ｈ 蔗糖消耗量。蔗糖消耗計(jì)算公式為：蔗糖偏好百分比（％）＝［（蔗糖攝入量）/（蔗糖攝入量＋水的攝入量）］×100。

１．４．２．２強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（ｆｏｒｃｅｄ�。螅鳎椋怼。簦澹螅�，ＦＳＴ）采用上海欣軟信息科技有限公司的強(qiáng)迫游泳視頻分析系統(tǒng)，將小鼠分別放入玻璃燒杯中，水溫保持在２４－２６ ℃。讓小鼠在其中游泳２ｍｉｎ后，立刻開始觀察記錄接下來的４ｍｉｎ內(nèi)小鼠總的不動時(shí)間：即小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動。

1.4.2.3懸尾實(shí)驗(yàn)（ｔａｉｌ�。螅酰螅穑澹睿螅椋铮睢。簦澹螅�，TST）采用上海欣軟信息科技有限公司的懸尾測試視頻分析系統(tǒng)，用膠帶將小鼠懸掛于距臺面３０ｃｍ 的支架邊緣上，膠帶ｔｔ粘貼位置在距小鼠尾尖1cm處。每只小鼠共懸掛5min，記錄其在最后4min的不動時(shí)間。

1.4.2.4陌生環(huán) 境 攝 食 實(shí) 驗(yàn) （ｎｏｖｅｌｔｙ�。螅酰穑穑颍澹螅螅澹洌妫澹澹洌椋睿纭。簦澹螅�，ＮＳＦＴ）小鼠禁食 ２４ｈ 后，被放置在一個(gè)新的鼠籠內(nèi)，底部鋪上厚約１ｃｍ 的墊料，中心放置已經(jīng)稱重的糧食。放入后，檢測小鼠開始吃食的潛伏時(shí)間。以吃食的潛伏期和消耗食物的重量為觀測指標(biāo)。如果小鼠５ｍｉｎ內(nèi)沒有吃食則定義為潛伏時(shí)間是５ｍｉｎ。小鼠單位時(shí)間攝食量（ｇ）＝５ｍｉｎ內(nèi)消耗糧食重量（ｇ）／小鼠體質(zhì)量（ｇ）。

１．５統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理　 測 量 結(jié) 果 以 珔ｘ±ｓ表 示，應(yīng) 用ＳＰＳＳ　２０．０ 統(tǒng)計(jì)分析軟件對多組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，ｐｏｓｔ　ｈｏｃ�。簦澹螅暨x用 ＬＳＤ 方法，Ｐ＜０．０５為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

產(chǎn)后抑郁的病因復(fù)雜，與生物、社會、心理等因素密切相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PPD與多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子有明顯的關(guān)系，包括心理社會應(yīng)激，不良生活事件，既往和家庭心境障礙史等多方面因素。既往的應(yīng)激性生活事件被認(rèn)為是 PPD 發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，可能是因?yàn)槌掷m(xù)的應(yīng)激能增加易感性個(gè)體發(fā)生情感障礙的可能性。

本實(shí)驗(yàn)中，我們采用慢性孕前應(yīng)激對適齡BALB/ｃ雌鼠造模，通過對產(chǎn)后 3周母鼠的蔗糖偏好試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳測試、懸尾測試及陌生環(huán)境攝食測試評估該P(yáng)PD模型，發(fā)現(xiàn)該模型小鼠出現(xiàn)了快感缺失，興趣下降，行為絕望以及伴有焦慮現(xiàn)象，這與PPD患者的臨床癥狀極為相似，因此模型的建立是成功的。常規(guī)的PPD西醫(yī)治療主要包括心理治療和抗抑郁藥物治療。選擇性 ５－羥色胺再攝取抑制劑（Ｓｅ－ｌｅｃｔｉｖｅ�。樱澹颍铮簦铮睿椋睢。遥澹酰穑簦幔耄濉。桑睿瑁椋猓椋簦铮颍�ＳＳＲＩｓ）類是目前抗抑郁治療中應(yīng)用較多的一線抗抑郁藥物。氟西汀是ＳＳＲＩｓ類代表藥物，但其臨床上存在起效緩慢、影響哺乳等不良反應(yīng)，且有三分之一的病人對其無治療反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)２１ｄ的氟西汀給藥對孕前應(yīng)激誘導(dǎo)PPD模型小鼠的一系列抑郁樣行為均無明顯作用，提示該模型可能是一種難治性抑郁模型。這與目前研究認(rèn)為PPD屬于難治性抑郁的觀點(diǎn)相一致。目前越來越多的學(xué)者致力于尋求能夠治療難治性抑郁的快速起效抗抑郁藥物。

ＮＭＤＡＲ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ�。遥澹悖澹穑簦铮颍┑霓卓箘┞劝吠�目前被公認(rèn)為是可用于治療難治性抑郁、具有快速抗抑郁作用的藥物。在臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)上，單次亞麻醉劑量的氯胺酮即可發(fā)揮快速持久的抗抑郁的作用。但是，由于氯胺酮具有的神經(jīng)毒性和成癮性等副作用，使其不能用于臨床。我們可以氯胺酮為陽性參照，尋找具有與其一致的快速抗抑郁作用且沒有其副作用的理想藥物。近代中醫(yī)認(rèn)為產(chǎn)后抑郁癥可歸屬于中醫(yī)“郁病”范疇。產(chǎn)后抑郁病因復(fù)雜，幾種病因又相兼為病，虛實(shí)夾雜，以郁為主。同時(shí)現(xiàn)代女性由于受家庭、生活等方面的壓 力，郁 證 尤 多，出 現(xiàn) “六 郁 并 集、諸 郁 并見”的病因病機(jī)。這與朱丹溪對于郁證的認(rèn)識相同。丹溪指出：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉”并創(chuàng)立了越鞠丸。《丹溪心法》云：“越鞠丸，解諸郁”。該方由蒼術(shù)、川芎、香附、神曲、山桅組成，專為郁病而設(shè)，重在理氣解郁，兼顧六郁。

古往今來越鞠丸作為治療抑郁癥的經(jīng)典方劑，許多學(xué)者對其進(jìn)行了研究。于雷統(tǒng)計(jì)了近３０年的越鞠丸治療抑郁癥的臨床案例，發(fā)現(xiàn)其總有效率達(dá)９３．６５％，且副作用很低。尉小慧對越鞠丸抗抑郁活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)越鞠丸抗抑郁樣作用是全方配伍綜合作用的效果。本課題組前期發(fā)現(xiàn)以越鞠丸單次給藥，在ＩＣＲ 和昆明小鼠上具有與氯胺酮相似的快速抗抑郁功效。本研究發(fā)現(xiàn)單次給予ＹＪ２４ｈ后能夠顯著改善孕前應(yīng)激PPD小鼠模型的行為 學(xué) 指 標(biāo) 。與ＰＰＤ模 型 組 相 比 ，ＹＪ組 顯 著 增 加 模型母鼠的糖水偏愛百分比，降低模型母鼠在強(qiáng)迫游泳測試和懸尾測試中的絕望不動時(shí)間，縮短模型母鼠陌生環(huán)境攝食測試中的潛伏時(shí)間和增加其單位時(shí)間內(nèi)攝食量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)在孕前應(yīng)激PPD小鼠模型上，ＹＪ 具有與氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。

總之，孕前應(yīng)激誘導(dǎo)的 PPD小鼠模型是一種具有實(shí)驗(yàn)研究價(jià)值的PPD動物模型。常規(guī)抗抑郁藥物氟西汀的慢性給藥對該模型無明顯治療作用，提示該模型可能是一種難治性抑郁模型。而ＹＪ對PPD小鼠模型具有與氯胺酮相似的快速抗抑郁作用，提示越鞠丸可用于治療難治性抑郁。本研究為快速治療PPD的中藥新藥研發(fā)提供了依據(jù)，可以更好地指導(dǎo)產(chǎn)后抑郁癥的治療。