【摘要】 目的觀察條件恐懼實驗對于小鼠認知功能和線粒體功能的影響。方法成年雄性C57BL／6小鼠60只隨機分為四組：假手術+生理鹽水組(SN組，”一10)、假手術+SS 31組(ss組，n—lo)、盲腸結扎穿孔(CLP)+生理鹽水組(CN組，”一20)和CLP+SS31組(cs組，”一20)。術畢每天腹腔注射5 rag／kg SS 31(ss、CS組)或等容生理鹽水(SN、CN組)，連續(xù)6 d。術后第7、8天，行條件恐懼實驗；行為學測試后處死小鼠，取海馬組織檢測活性氧自由基(ROS)及三磷酸腺苷(ATP)水平，提取線粒體檢測線粒體電子傳遞鏈復合物工、T『、『『『、Ⅳ酶活性及線粒體膜電位(MMP)水平。結果與CN組比較，SN、SS和CS組24 h場景實驗僵直時間明顯增加(P<0．05)，ROS水平明顯降低，ATP、MMP及復合物工和仃『酶活性明顯升高(Pd0．05)。與CS組比較，SN和SS組ROS水平明顯降低，人TP、MMP及復合物I和m酶活性明顯升高(P<0．05)。結論線粒體抗氧化肽$531可改善膿毒性腦病小鼠認知功能，其機制可能與減輕線粒體損傷有關。
【關鍵詞】 膿毒癥；認知；線粒體；抗氧化劑；小鼠

膿毒性腦病(sepsis associated encephalopathy，SAE)表現(xiàn)為長期的自主神經(jīng)功能紊亂、譫妄和認知功能障礙，其確切機制尚不清楚，且缺少有效治療措施。研究表明線粒體功能紊亂在膿毒癥多器官功能障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用，推測線粒體功能紊亂可能是SAE病理生理學機制之一。線粒體抗氧化肽SS 31可清除線粒體內活性氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)及增加三磷酸腺苷(adenosine 5’triphosphate，ATP)水平，具有明顯的線粒體保護作用。本研究觀察SS 31對SAE小鼠認知功能及線粒體功能的影響，為SAE的防治提供參考。

材料與方法

動物選擇與分組成年雄性C57BL／6小鼠60只，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，體重20～28 g。隨機分為四組：假手術+生理鹽水組(SN組，n 10)、假手術+SS-31組(ss組，咒一lo)、CLP+生理鹽水組(CN組，n 20)和CLP+SS31組(cs組，n 20)。CN組和CS組采用盲腸結扎穿孔法(CLP)建立SAE模型，SN組和SS組僅做剖腹、分離盲腸遠端、關腹手術。術畢連續(xù)6 d，每天分別腹腔注射5mg／kg SS-÷31(SS和CS組，上海強耀生物科技有限公司)和等容生理鹽水(SN和CN組)。CLP模型建立術前禁食12 h，戊巴比妥鈉(40mg／kg，Sigma公司)腹腔注射麻醉，腹正中線做1 cm長的切口，游離腸系膜和盲腸，近盲腸根部1．2 CIll處以4-0絲線環(huán)形結扎，22號針頭于結扎端貫通穿刺兩次，擠出糞便少許，還納腸段，依次縫合腹膜和皮膚，所有操作均于8 min內完成。

行為學測試

術后第7天存活小鼠參照文獻進行條件性恐懼實驗。將小鼠置于75％酒精擦拭的實驗盒中探索180 S，隨后給予聲音刺激(80dB，3600 Hz)60 S，緊接著給予足部電刺激(0．75mA，1 s)，小鼠繼續(xù)適應180 S后取回。分別于訓練后2 h及24 h進行場景和聲音實驗，其中場景實驗主要反映海馬依賴性記憶，聲音實驗主要反映非海馬依賴性記。V,E8I。場景實驗將小鼠放入相同的環(huán)中390 S，記錄第2個180 S內僵直時間。聲音實驗將小鼠放不同的環(huán)境中390 S，第2個180 S時給予相同聲音刺激而無電擊，記錄僵直時問。實驗時采用條件恐懼實驗系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng))自動記錄小鼠在電擊箱內的活動狀態(tài)。每次實驗結束后，用75％的酒精擦洗底座，避免氣味對實驗的干擾。ROS和ATP水平檢測 行為學測試后各組取5只小鼠處死，取新鮮海馬組織勻漿，參照ROS試劑盒(fin海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)和ATP試劑盒(fin海碧云天生物技術有限公司)說明書步驟檢測ROS和ATP水平。復合物I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)檢測行為學測試后各組取5只小鼠處死取新鮮海馬組織，參照線粒體提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)說明書步驟提取并純化線粒體。復合物工、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性和MMP水平參照線粒體呼吸鏈復合物活性檢測試劑盒和純化線粒體膜電位熒光測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)說明書步驟進行操作。

統(tǒng)計分析

采用SPSS 17．o軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(i±s)表示，組問比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

結 果
條件性恐懼實驗本研究中，CN組與CS組小鼠死亡數(shù)分別為9只和6只，差異無統(tǒng)計學意義，SN組與SS組小鼠未見死亡，存活小鼠完成條件性恐懼實驗。與CN組比較，SN、SS和CS組24 h場景實驗僵直時間明顯增加(P

ROS、ATP和MMP水平變化 與CN組比較，SN、SS和CS組ROS水平明顯降低(P復合物工、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性 與CN組比較，SN、SS和CS組復合物工和Ⅲ活性明顯升高(P<0．05)；與CS組比較，SN和SS組復合物I和Ⅲ活性明顯升高(P<0．05)。

討 論

本研究觀察到CLP小鼠術后8 d時24 h場景實驗僵直時問明顯減少，表現(xiàn)為海馬依賴性的認知功能損傷，并伴隨海馬組織中ROS水平升高，ATP水平降低，以及線粒體中復合物工、Ⅲ酶活性和MMP水平的降低，我們推測線粒體電子傳遞鏈功能損傷引起ROS水平增加和ATP水平降低是膿毒癥線粒體功能紊亂及SAE認知功能障礙的發(fā)病機制之一。

膿毒癥時，不同組織線粒體電子傳遞鏈損傷不盡相同。Comim等觀察到CLP大鼠24、48和96h時小腦、海馬、紋狀體和腦皮質線粒體復合物工酶活性明顯降低，復合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性未見明顯改變，而d’Avila等觀察到CLP大鼠24 h時腦組織復合物Ⅳ活性明顯降低。此外，Peruchi等E113觀察到CLP大鼠骨骼肌組織中復合物Ⅱ、Ⅲ酶活性12 h時降低，48 h時所有復合物活性均降低。Zapelini等則觀察到肝組織中復合物Ⅳ活性3～48 h時降低。而在本研究中，我們觀察到CLP小鼠8 d時，大腦海馬組織中復合物工和Ⅲ酶活性明顯降低，復合物Ⅱ和Ⅳ酶活性無明顯改變，這一變化可能與CLP的時問及組織不同有關。線粒體電子傳遞鏈復合物酶活性及MMP是線粒體功能的重要參數(shù)，其中復合物工和Ⅲ是細胞內ROS產(chǎn)生的主要部位，其活性降低可引起ROS明顯增加。而MMP是ATP形成的先決條件，在電子傳遞的過程中，質子可通過復合物工和Ⅲ逆濃度梯度進入線粒體膜外形成線MMP，并經(jīng)過ATP合酶順濃度梯度進入線粒體產(chǎn)生ATP，所以復合物工和Ⅲ酶活性降低可引起MMP降低，進而引起ATP產(chǎn)生的減少。故本研究中CLP引起小鼠海馬線粒體功能紊亂，主要表現(xiàn)為線粒體復合物工和Ⅲ酶活性和MMP水平降低且伴隨ROS水平增加以及ATP水平的降低。

線粒體抗氧化肽SS-31可自由通過血腦屏障和細胞膜，在線粒體內膜濃度為線粒體外濃度1 000倍以上，且不依賴于線粒體膜電位。SS 31可清除細胞內各種ROS如過氧化氫(H。O。)、超氧陰離子(OF)及羥自由基(·OH)等，具有增加ATP的產(chǎn)生及穩(wěn)定線粒體膜電位等作用，在神經(jīng)退行陛疾病、代謝性疾病以及缺血一再灌注損傷等疾病中發(fā)揮重要保護作用。本研究我們觀察到SAE小鼠模型中連續(xù)給予SS-31可使24 h場景實驗僵直時間增加，改善小鼠認知功能，并減少海馬組織中ROS水平，增加ATP和MMP水平，以及抑制復合物工和Ⅲ酶活性的降低，具有明顯的線粒體保護作用。

綜上所述，線粒體功能紊亂可能是SAE認知功能障礙的病理生理學機制之一，連續(xù)給予線粒體抗氧化肽SS 31可改善膿毒性腦病小鼠的認知功能，其作用可能與保護線粒體功能有關。