Western Blot又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標(biāo)蛋白，通過酶促反應(yīng)或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標(biāo)蛋白可視化，從而對蛋白進(jìn)行定性或者定量研究。

抗體與抗原之間的特異性識別是Western Blot實驗中最為關(guān)鍵的一個步驟，選擇的抗體是否合適、抗體的質(zhì)量優(yōu)劣都關(guān)乎實驗的成敗。下面將從高品質(zhì)抗體的選擇、驗證數(shù)據(jù)對抗體的重要性及內(nèi)參抗體的選擇標(biāo)準(zhǔn)等方面給大家一些建議。

√ 質(zhì)量是甄選優(yōu)質(zhì)抗體的首要標(biāo)準(zhǔn)

市面上常見的抗體有進(jìn)口品牌、國產(chǎn)品牌、進(jìn)口品牌國內(nèi)分裝這幾種類型。大部分進(jìn)口品牌在抗體的質(zhì)量、特異性、效價及保存條件方面較有保障。而有些國產(chǎn)品牌的抗體，在做Western Blot時，由于其特異性不高，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)背景不干凈，非特異性條帶多等問題。進(jìn)口品牌國內(nèi)分裝則是個別經(jīng)銷商從廠家買到產(chǎn)品后，再通過稀釋、分裝、重新貼牌之后賣給客戶，這樣的抗體雖然價格相對便宜，但質(zhì)量良莠不齊，批間差異較大。

要確�？贵w的高質(zhì)量，我們通常是選擇可信賴的品牌，此外，還應(yīng)注意抗體的供應(yīng)商渠道是否正規(guī)，其供應(yīng)鏈物流是否專業(yè)。

√ 完善的驗證數(shù)據(jù)是抗體選擇的必要參考

優(yōu)質(zhì)抗體還應(yīng)具備完善的驗證數(shù)據(jù)和詳細(xì)的信息標(biāo)注，比如：是否明確標(biāo)注其可以用于Western Blot、是否有足夠的數(shù)據(jù)支持證明該抗體適用于某一組織或者樣本、是否有明確的抗體建議稀釋濃度、該抗體的識別位點是連續(xù)的氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)還是非連續(xù)性氨基酸的三維結(jié)構(gòu)位點……這些信息和數(shù)據(jù)的真實性及完整性是保證Western Blot實驗順利進(jìn)行的關(guān)鍵。

關(guān)于這一點，HPA金標(biāo)抗體及其所提供的數(shù)據(jù)是一個很好的案例。HPA抗體數(shù)據(jù)庫覆蓋了人類85%的蛋白，每支抗體均通過嚴(yán)格的抗原序列篩選及親和層析純化流程，確保其特異性和純度。此外，每支抗體在多種組織樣品中經(jīng)過蛋白芯片、Western Blot、免疫組化、免疫熒光等實驗的驗證，并獲得學(xué)術(shù)委員會的認(rèn)證。作為重要的參考數(shù)據(jù)，所有的實驗驗證、發(fā)表文獻(xiàn)和生物信息學(xué)預(yù)測都公布在proteinatlas.org網(wǎng)站供大家免費查詢。完善的實驗數(shù)據(jù)支持可避免因信息不完整而造成的選擇錯誤。

√ 有效的內(nèi)參抗體是實驗準(zhǔn)確的重要憑證

在Western Blot中，內(nèi)參是由持家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用來做參照物。借助內(nèi)參校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，是證明Western Blot實驗結(jié)果真實可靠的重要憑證。一些常見的內(nèi)參基因及抗體包括β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin等。

值得注意的是，不同的內(nèi)參抗體只適用于一定范圍的樣本和組織，我們需要查閱參考文獻(xiàn)，并根據(jù)樣本和組織的差別選擇合適的內(nèi)參抗體，以確保實驗的準(zhǔn)確性。（如下表所示）

在Western Blot中如果抗體選擇或使用不當(dāng)，可能會造成無信號、弱信號、高背景、有雜帶等實驗問題，下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。

以上是關(guān)于Western Blot實驗過程中如何選擇合適的、高品質(zhì)抗體的一些建議，以及由于抗體選擇和使用不當(dāng)而造成實驗失敗的問題總結(jié)，希望能給大家一些幫助和啟發(fā)。