細胞凋亡和細胞壞死的本質(zhì)均為細胞死亡，但我們可以通過其發(fā)生機制和病理形態(tài)學方面所表現(xiàn)出的特征加以區(qū)別。細胞凋亡指的是細胞程序性的死亡，不會發(fā)生細胞膜損傷，細胞壞死則被認為是因病理而產(chǎn)生的被動死亡，會伴隨發(fā)生細胞膜損傷，導致細胞質(zhì)因子的釋放并引起炎癥反應。進行抗腫瘤藥物篩選過程中，區(qū)分引起的是細胞調(diào)亡和細胞壞死變得非常重要，因為后者的主要副作用是引起細胞的炎癥反應。這里我們介紹了利用SeptraMax Paradigm（Molecular Devices）和 Vybrant 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）進行這方面的研究。

 

Vybrant 細胞凋亡檢測試劑盒是基于Annexin V 和Sytox Green 兩種標記物的基礎上開發(fā)出的，可以快速和簡便的區(qū)分腫瘤細胞的凋亡和壞死情況， Annexin V 一種人類血管抗凝劑，標記有藻紅蛋白（R-PE）后通常用來檢測凋亡細胞的發(fā)生，其工作原理是正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)側(cè)，當細胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V 是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸具有高度的親和力。相反，Sytox Green 染料不能滲透進入活細胞和凋亡細胞，但可以進入壞死細胞并對其細胞核進行染色，發(fā)出很強的綠色熒光。我們提前將腫瘤細胞種在384 孔板中，然后分別使用腫瘤壞死因子（TNF）和更生霉素（Actinomycin-D）來誘導細胞凋亡，使用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)誘導細胞壞死。此外，我們可通過檢測細胞組織表達的不同物質(zhì)其抗腫瘤特性和分化特性來區(qū)分細胞凋亡和細胞壞死。

 

SpectraMax Paradigm 是美國Molecular Devices 公司推出的一種全新概念的多功能檢測平臺（如圖一）。它將光源系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)獨立分開，多套檢測器同時固定在主機上，針對不同實驗要求選用不同的卡盒，每一種卡盒其實就是獨立的光路系統(tǒng)，可以提高了檢測針對性和靈敏性。針對此試驗特點，如儀器具有能夠同時檢測Annexin V 和Sytox Green 兩種標記物發(fā)射熒光強度話可大大提高檢測的效率（如圖二），而Paradigm 所具有的雙通道檢測器可同時工作，非常適合此類試驗要求。

 

圖一：SpectraMax Paradigm 多功能檢測平臺

 

 

圖二. 1:HepG2 細胞提前24 小時種在平底的384 孔板中，這些孔中的一部分細胞未經(jīng)任何處理，而另一部分細胞試驗前18 小時分別用TNF(25ng/ml)、 Actinomycin-D（1ug/ml）和Triton X-100(0.1%)孵育，然后去除微孔板中培養(yǎng)基，將兩種標記物分子溶解在緩沖液中，37度孵育20 分鐘。染色后，分別使用SpectraMax Paradigm 多功能檢測平臺的single-point(1a)、on-the-fly(1b)和area-scan(1c)模式檢測結(jié)果，每個柱高度代表著平均熒光強度值（RFU）和5個重復孔的標準偏差�？梢钥闯鰭呙杩變�(nèi)面積越大，得出結(jié)果就會更加的精確，尤其適合像腫瘤細胞的這種單層不均一類型細胞的檢測試驗。

 

綜上我們可以發(fā)現(xiàn)， SpectraMax Paradigm 是基于細胞學應用的理想檢測平臺， 如使用Vybrant 細胞凋亡檢測試劑盒所呈現(xiàn)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，孔內(nèi)細胞層的變化非常快速而且對整個試驗結(jié)果的影響較大，Paradigm 所具有的”O(jiān)n-the-fly”數(shù)據(jù)收集模式可以很好的解決此問題。高速的雙發(fā)射檢測器可針對每個孔測量的多數(shù)據(jù)點畫出線性圖，從而得到一個更大測量區(qū)域的數(shù)值，將會得出更好的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果。當使用“area scan”功能后可以進一步提高基于細胞學應用試驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量。此外，此款儀器所具有的雙通道同時檢測的功能可以大大縮短檢測時間，提高工作的效率。

 

非常感謝奧地利克雷姆斯高等專業(yè)學院醫(yī)藥生物技術部門所提供的研究數(shù)據(jù)。