1.儀器具有超高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能，最低至10個(gè)細(xì)胞/每孔

2.微孔板讀板高度自動(dòng)優(yōu)化設(shè)置，可提高檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度 軟件預(yù)置

3.軟件預(yù)置模板可以更快分析出檢測(cè)結(jié)果

 

SpectraMax i3x是Molecular Devices公司最新推出的一款多功能微孔板讀板機(jī)，可利用儀器所具有的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能，進(jìn)行細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性相應(yīng)檢測(cè)。儀器可靈敏、快速檢測(cè)出培養(yǎng)基中活細(xì)胞的數(shù)目和經(jīng)相應(yīng)處理后細(xì)胞毒性情況。Promega公司推出的CellTiter-Glo試劑是利用了螢火蟲熒光素酶反應(yīng)體系中需要ATP參與才能使其發(fā)光的特點(diǎn)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱取決于培養(yǎng)基中ATP含量的高低，也就是依賴于其中活細(xì)胞數(shù)目的多少。來自于BioVision公司基于生物化學(xué)發(fā)光原理的細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，目的是檢測(cè)腺苷酸激酶(AK)的含量，AK為一種存在于所有細(xì)胞中的常見蛋白，當(dāng)破壞了細(xì)胞膜完整性后其會(huì)釋放至培養(yǎng)基中，AK可轉(zhuǎn)化ADP至ATP，所以可以利用類似方式進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

 

. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega P/N G7570)

. Bioluminescence Cytotoxicity Assay Kit (BioVision P/N K312-500)

. HeLa .細(xì)胞(ATCC P/N CCL-2)

. 黑色底透 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning P/N 3904)

. 白色96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning P/N 3917)

. SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機(jī)

 

使用前預(yù)先將CellTiter-Glo緩沖液和底物解凍并且平衡其至室溫，將CellTiter-Glo緩沖液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照試劑盒說明書提示，將試劑輕輕反復(fù)顛倒進(jìn)行混勻。對(duì)于生物化學(xué)發(fā)光細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，其中包含了1瓶AK檢測(cè)試劑，此試劑使用前預(yù)先將1.1ml AK試劑緩沖液加入其中并輕輕混勻，需在室溫環(huán)境下平衡15分鐘后使用。這個(gè)10X的AK試劑的儲(chǔ)存液需要稀釋后才能成為試劑緩沖液。

Hela 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和雙抗的MEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，使其懸浮于培養(yǎng)基中進(jìn)行計(jì)數(shù)。處理后的細(xì)胞鋪在96孔板中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋后其密度從50,000細(xì)胞每孔/100ul至10個(gè)細(xì)胞每孔/100ul。如果將細(xì)胞鋪在384孔板時(shí)，稀釋后密度從12,500細(xì)胞每孔/25ul至6個(gè)細(xì)胞每孔/25ul。對(duì)照孔中僅需加入細(xì)胞培養(yǎng)基用于檢測(cè)其背景的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值。

細(xì)胞試驗(yàn)過程中，精確的細(xì)胞數(shù)目可用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，將不同體積的CellTiter-Glo試劑加入相應(yīng)的孔板中，如100ul(96孔板)或25ul(384孔板)。將微孔板放置于振蕩器上輕混2分后，室溫條件下孵育10分鐘，等化學(xué)發(fā)光信號(hào)值穩(wěn)定后再進(jìn)行檢測(cè)。

 

ATP以1:10稀釋度進(jìn)行稀釋后加入96孔板和384孔板中，濃度從10uM至1nM，不加細(xì)胞的孔作為空白孔。CellTiter-Glo試劑可用于檢測(cè)ATP，檢測(cè)前可利用SpectrMax i3x具有的微孔板優(yōu)化設(shè)置和讀取高度優(yōu)化設(shè)置功能，幫助你獲得更佳信號(hào)值。

 

將Hela細(xì)胞預(yù)鋪在白色底透的細(xì)胞培養(yǎng)型96孔板中，密度為15,000/孔，培養(yǎng)過夜。第二天在細(xì)胞孔中加入十字孢堿(staurosporine)和茴香霉素(anisomycin)這兩種化合物來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這兩種化合物起始濃度都為50uM，并以1:2方式稀釋至24nM。再經(jīng)過24小時(shí)孵育以后，分別使用CellTiter-Glo細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒和BioVision的細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)于CellTiter-Glo細(xì)胞活力檢測(cè)試驗(yàn)，將100ul的CellTiter-Glo試劑加入含有細(xì)胞的白色微孔板中，等10分鐘左右，當(dāng)細(xì)胞徹底裂解以后再進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

 

對(duì)于BioVision細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)，每孔中取100ul處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基，將其轉(zhuǎn)移至白色微孔板中，并在白色微孔板中加入100ul的AK工作液，此方法需要在30分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。

SpectraMax i3x讀板機(jī)參數(shù)設(shè)置如表一所示。使用專業(yè)級(jí)別的SoftMax. pro軟件后，可直接獲得平均相對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)值(RLU)和標(biāo)準(zhǔn)偏差值。直接繪制出細(xì)胞稀釋度曲線和ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇其中的4參數(shù)擬合方式進(jìn)行擬合后快速計(jì)算出其IC₅₀值。軟件預(yù)置模板庫(kù)中還有針對(duì)CellTiter-Glo檢測(cè)試驗(yàn)的模板可方便直接調(diào)用。

 

 

SpectraMax i3x讀板機(jī)針對(duì)96孔板和384孔板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，最低檢測(cè)下限可至10細(xì)胞每孔。此種檢測(cè)方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)比色法和絕大多數(shù)熒光法。CellTiter-Glo試劑檢測(cè)線性范圍覆蓋所有細(xì)胞濃度區(qū)間，動(dòng)態(tài)學(xué)檢測(cè)范圍大于3個(gè)數(shù)量級(jí)且r2 > 0.99（圖一）。

 

 

ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線既可以驗(yàn)證試驗(yàn)條件也可以用來計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。因此ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍從1nM至10uM產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)范圍可覆蓋整個(gè)不同細(xì)胞數(shù)目孔中產(chǎn)生的信號(hào)值(圖二)，檢測(cè)的線性范圍大于四個(gè)數(shù)量級(jí)。

 

 

經(jīng)十字孢堿(staurosporine)和茴香霉素 (anisomycin)等化合物處理后細(xì)胞其活力的變化可通過檢測(cè)ATP水平而實(shí)現(xiàn)(圖三)。細(xì)胞毒性可以通過檢測(cè)其AK量變化而實(shí)現(xiàn)(圖四)。十字孢堿(0.34uM和0.15uM)和茴香霉素(3.30uM和2.28uM)兩次處理試驗(yàn)獲得相似的IC₅₀值。

 

 

 

 

 

在利用SpectraMax i3x讀板機(jī)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能進(jìn)行基于ATP變化的細(xì)胞活力和基于AK變化的細(xì)胞毒性檢測(cè)時(shí)其表現(xiàn)出了超高靈敏性，檢測(cè)下限可至10個(gè)細(xì)胞每孔�？赏ㄟ^專業(yè)級(jí)別的SoftMax Pro 軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合，隨后直接計(jì)算出IC50值。軟件可以自動(dòng)優(yōu)化微孔板的檢測(cè)高度，可幫助用戶獲得最佳的信號(hào)值。

主機(jī)除了具有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能以外，SpectraMax i3x讀板機(jī)可升級(jí)具有更多檢測(cè)功能以滿足用戶對(duì)不同試驗(yàn)的不同檢測(cè)需求。此儀器的光吸收和熒光強(qiáng)度檢測(cè)功能， 光源采用了專利的光譜融合技術(shù)(Spectra FusionTM Illmumination)使其既可以兼顧了波長(zhǎng)靈活性也可以獲得最佳檢測(cè)信號(hào)。

主機(jī)可加入具有新檢測(cè)功能的卡盒，用戶自己可隨時(shí)進(jìn)行功能升級(jí)，包括時(shí)間分辨熒光檢測(cè)功能和Western Blot檢測(cè)功能，也可選配Spectra. MiniMaxTM 300細(xì)胞成像模塊，擴(kuò)展此讀板機(jī)檢測(cè)能力和應(yīng)用范圍。儀器所有功能均可以使用一種軟件進(jìn)行操作，即專業(yè)級(jí)別的SoftMax Pro軟件，其中包含了CellTiter-Glo等近120預(yù)置檢測(cè)模板可方便用戶自己快速進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析。