一種在氣-液界面，空氣與細(xì)胞直接接觸的實(shí)驗(yàn)方法，由Cultex公司Aufderheide教授提出。細(xì)胞頂部表面直接暴露于一個(gè)恒流的大氣環(huán)境中，底部有培養(yǎng)基供給，并有恒定溫度及CO₂環(huán)境。2009年，Cultex公司提出了經(jīng)典的輻射流氣道設(shè)計(jì)（Radial Flow System -Cultex^® RFS)，Cultex RFS被譽(yù)為細(xì)胞體外暴露方法中最成功的技術(shù)。

2014年，Cultex公司推出第三代細(xì)胞暴露染毒系統(tǒng)Cultex RFS Compact，細(xì)胞氣液界面的直接暴露。在RFS技術(shù)基礎(chǔ)上，compact增加了細(xì)胞培養(yǎng)暴露腔室數(shù)量，共計(jì)6個(gè)cell culture inserts，并分為兩組，可對(duì)其中一組（三個(gè)cell culture inserts）進(jìn)行霧霾顆粒物暴露，另一組進(jìn)行清潔空氣暴露的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，或6個(gè)腔室全部進(jìn)行受試物/潔凈空氣的暴露實(shí)驗(yàn)。

系統(tǒng)內(nèi)6腔室徑向分布，保證顆粒物均勻的分布到每個(gè)腔室。電加熱系統(tǒng)為細(xì)胞體外培養(yǎng)提供最佳溫度條件，專門的CO₂接入單元保證細(xì)胞進(jìn)行更長時(shí)間的體外暴露。系統(tǒng)集成到一個(gè)帶有緊鎖裝置的支架中，保證系統(tǒng)的氣密性。Cultex RFS Compact經(jīng)過Cultex實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同受試物質(zhì)氣溶膠的劑量反應(yīng)（dose-response），及不同暴露時(shí)間對(duì)受試物質(zhì)細(xì)胞毒性的劑量依賴（dose-dependent）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明其具有高度的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性及可靠性。

材料和方法

1、  Cultex RFS Compact

2、  6.5mm或12mm的細(xì)胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）

3、  Bronkhorst高精度MFC

4、  培養(yǎng)基灌注系統(tǒng)

5、  細(xì)胞株（ATCC：ccl-185）和分離的原代正常人支氣管上皮細(xì)胞（NHBE）

       

圖 1: 兩種氣路分布的CULTEX® RFS Compact

左圖: 三個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）暴露于受試氣溶膠，另外三個(gè)平行暴露于潔凈空氣

右圖: 六個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）全部暴露于受試氣溶膠或潔凈空氣

顆粒物暴露實(shí)驗(yàn)在Cultex® RFS Compact中進(jìn)行，細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)小室中（well cell culture insert，COSTAR®/Corning），在氣-液界面直接接觸暴露顆粒物24小時(shí)。在實(shí)   驗(yàn)過程中，細(xì)胞底部持續(xù)供給培養(yǎng)基，并通過電加熱系統(tǒng)保證環(huán)境穩(wěn)定在37°C。

香煙煙霧（全煙氣/氣相-K3r4F）和1.6%尼古丁液（電子煙）作為受試物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)。

用WST-1法測(cè)定細(xì)胞活性。對(duì)于電子香煙的細(xì)胞暴露，同時(shí)分析細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。暴露24后進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果與清潔空氣控制組進(jìn)行對(duì)比（圖2和圖3）。兩組之間存在顯著差異，而符號(hào)（星號(hào)）定義如下：

**** p < 0.0001非常顯著,            *** p = 0.0001 – 0.001 非常顯著,

**  p = 0.001 – 0.01 很顯著,          * p = 0.01 – 0.05 顯著

圖2: 采用WST-1分析法分析香煙煙氣（全煙氣/氣相）對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果與潔凈空氣控制組的對(duì)比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

對(duì)比清潔空氣，10支香煙主流煙氣降低A549細(xì)胞的活性。隨著更多數(shù)量煙氣的暴露，細(xì)胞活性逐漸減小，同時(shí)全煙對(duì)細(xì)胞活性的影響更加明顯，相比煙氣相。暴露在清潔空氣中的細(xì)胞與細(xì)胞孵化箱中細(xì)胞的活性未有明顯變化。

圖3: 香煙煙霧和1.6%尼古丁液（電子煙）對(duì)NHBE暴露后的細(xì)胞毒性作用和氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果與潔凈空氣控制組的對(duì)比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

對(duì)NHBE細(xì)胞，細(xì)胞活力和氧化應(yīng)激水平的影響是相對(duì)的。暴露于電子煙液的細(xì)胞，細(xì)胞活性降低并氧化應(yīng)激水平的增加。主流煙氣的暴露，細(xì)胞的更低存活率和更高的氧化應(yīng)激。清潔空氣控制組的細(xì)胞比孵化器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出較高的氧化應(yīng)激，這是由于清潔空氣氣流對(duì)細(xì)胞的機(jī)械剪切力刺激的結(jié)果。所以，孵化器和清潔空氣控制的細(xì)胞存活率差異不顯著。

•  CULTEX® RFS Compact適用于6個(gè) 6.5 mm 或 12 mm 現(xiàn)有的通用細(xì)胞培養(yǎng)小室（COSTAR®和 Falcon®）的直接暴露。

•  每個(gè)CULTEX® RFS Compact 內(nèi)可進(jìn)行兩組平行實(shí)驗(yàn)，三個(gè)培養(yǎng)小室（cell culture inserts）用于受試物，另外三個(gè)平行用于清潔空氣或不同濃度受試物。

•  數(shù)據(jù)顯示其具有良好的劑量效應(yīng)和高度的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

•  適用于氣體為載體的各種受試物質(zhì)，如香煙煙霧、納米顆粒、PM2.5、PM10、VOCs、霧霾混合物、干粉顆粒物及霧化氣溶膠等等。