多功能酶標儀技術的革命——LVF光柵在FRET和BRET分析中的優(yōu)異表現
例如在檢測GFP，mKate，mOrange和CFP-YFP等熒光蛋白時，光柵型酶標儀得不到理想的效果，在FRET和BRET等雙發(fā)射分析中更是如此。光柵型酶標儀無法實現這些應用的一個明顯原因是我們需要30nm以上的帶寬，實際上，在一些BRET分析中我們需要60到100nm的帶寬，而目前傳統(tǒng)的光柵往往只有狹窄的固定的帶寬或者有限可調的帶寬（不超過30nm），根本無法滿足檢測要求。另一個原因是這些應用的信號比較弱，發(fā)射光遠遠少于常用的染料，如FITC或者rhodamine，而光柵的透光效率又遠遠低于濾光片，光強損失太大，勢必降低靈敏度。
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LVF光柵的高靈敏度除了因為更寬的帶寬，還有兩個原因，一是LVF光柵是基于濾光片的透射原理而不是傳統(tǒng)光柵的衍射；二是由于光路設計的不同， LVF光柵通過直接的光學組件取代光纖來傳導信號（光纖傳導會造成光強的損失）；因此，LVF光柵可以提供比傳統(tǒng)衍射光柵多5到10倍的光線，從而大大提高了靈敏度。目前LVF光柵已經被運用于BMG最新一代的多功能酶標儀——CLARIOstar。
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對于科研工作者來說，一個巨大的挑戰(zhàn)是如何將基于顯微鏡的熒光蛋白分析轉化為基于微孔板的分析。現在有了LVF光柵我們可以在多功能酶標儀上選擇與顯微鏡相同的波長和帶寬，從而實現顯微鏡和酶標儀之間的無縫銜接。 |
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例如，Figure 2顯示的是分別用共聚焦顯微鏡和CLARIOstar檢測HEK293細胞中mTFP1和YFP之間的FRET。 在顯微鏡上，我們選擇波長480nm、帶寬30nm和波長535nm、帶寬45nm的兩塊濾光片來分別檢測mTFP1和YFP的信號， 在CLARIOstar上，我們通過LVF光柵選擇相同的波長和帶寬做為起點，經過優(yōu)化之后我們在酶標儀上得到了與共聚焦顯微鏡相同的FRET效率，從而實現了從顯微鏡分析到高通量微孔板分析的無縫轉化。 | |
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