1. 問：多克隆抗體的優(yōu)勢是什么?
答：多克隆抗體能夠同時識別具有多種不同表位的抗原，具有能夠容忍抗原微小的改變?nèi)缇酆匣蜉p微的變性。檢測變性蛋白質(zhì)多克隆抗體是理想的選擇。

2. 問：血清中的多克隆抗體的具體濃度是多少?
答：最常見的是，血清中特異性抗體濃度變化是0.05-0.2 mg/ml (基于Agrisera通過數(shù)以百次親和純化的內(nèi)部評估)。在特殊情況下，較好的多克隆血清能包含特異性抗體1- 3 mg/ml的血清(甚至更多)。

3. 問：單克隆抗體的優(yōu)勢是什么?
答：單克隆抗體僅能識別一種抗原表位，這在某些情況下可能是個缺點，如免疫沉淀反應(yīng)和用于免疫親和柱時。單克隆抗體作為一抗用于檢測組織中抗原是非常好的。理論上與多克隆抗體相比他們應(yīng)該具有更低的背景，但并不總是這樣。單克隆抗體具有較高的同質(zhì)性， 結(jié)果具有高度可重復(fù)性 (如果其他實驗條件可以保持不變)。

4. 問：當選擇一個肽用于免疫原，什么是重要的?
答：通常蛋白的C 端或N端是蛋白質(zhì)中暴露機會最高的部分。另外，為了模仿蛋白的行為，合成的肽應(yīng)該有類似于蛋白質(zhì)"cut out off"后的結(jié)構(gòu)和電荷。
因此：
----來源于C端的多肽那么N端應(yīng)用乙�；�修飾
----來源于N端的多肽那么C端應(yīng)用酰胺化修飾
----來源于內(nèi)部序列的多肽則需要肽的兩端都修飾
下面的幾點因素也在考慮范圍內(nèi)：
----你感興趣的蛋白家族里是否有其他的蛋白質(zhì)，應(yīng)該避免交叉反應(yīng)的發(fā)生。
----蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)（或同源蛋白）已知嗎？這將有利于研究肽的科學家找到最好的用于抗體生產(chǎn)的肽。
----生產(chǎn)的抗體的最終應(yīng)用？天然的或變性的技術(shù)？

5. 問：什么樣的抗原(s)可以用于注射?
答：天然蛋白，重組蛋白，多肽碳水化合物或其他微生物、細菌、病毒提取物可用于免疫接種，需要大小為5 - 10 kDa的小分子誘導充分的免疫反應(yīng)，有生物毒害的材料禁止用于免疫接種。
重要提示：
----如果抗體作用于變性的靶標蛋白 (例如：免疫印跡、固定組織免疫組化)，變性的抗原是首選(如凝膠塊， 包涵體蛋白質(zhì))。
----如果使用的抗體的目標蛋白質(zhì)是天然蛋白(例如：免疫沉淀反應(yīng))，非變性的抗原是首選(蛋白質(zhì)溶解在不含變性劑的溶液中)。
----并不是所有anti-peptide抗體都能識別天然蛋白質(zhì)，因此謹慎選擇肽序列是至關(guān)重要的。
----通過重組蛋白在細菌表達體系誘導所制備的抗體在某些情況下無法識別天然蛋白質(zhì)。原因可能是在細菌細胞中表達的蛋白質(zhì)抗原發(fā)生錯誤的折疊。
不能保證用于任何的免疫反應(yīng)中都能得到很好的成功。
相關(guān)參考文獻：
"Monoclonal antibodies： principles and practice" by James W. Goding， 1996， ISBN 0-12-287023-9;
Publisher： Academic Press. Using Antibodies： A Laboratory Manual， E.Harlow and D.Lane， 1999， ISBN： 0879695447;
Publisher： Cold Spring Harbor Laboratory Press. Hjelm et al. (2012). Parallel immunizations of rabbits using the same antigen yield antibodies with similar， but not identical， epitopes. PLOS ONE.

6. 問：用于免疫接種的抗原需要多少量?
答：這取決于抗原的免疫原性。在標準試驗方案中(對于兔、山羊或母雞)我們使用：大約500µg肽/動物/ 15周齡，約400µg蛋白質(zhì)/動物/ 15周齡。？  
如果所選動物抗原和抗體之間的關(guān)聯(lián)性較低，免疫接種時較少量的抗原(少于10µg)也是可以接受的。我們還可以使用自己的免疫方案。如果蛋白質(zhì)需要濃縮，請注意，在某些情況下，在濃縮設(shè)備中蛋白會部分附著在膜上從而部分蛋白質(zhì)損失。

7. 問：為什么抗原誘導反應(yīng)只會產(chǎn)生一些IgM抗體?
答：由于缺乏T細胞刺激(Goding ，1993)，高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)的響應(yīng)往往很薄弱，主要導致IgM抗體的產(chǎn)生，不過，也有例外。如果是保守的哺乳動物抗原，則使用親源關(guān)系遠的物種如母雞。

8. 問：用于免疫接種的抗原應(yīng)如何制備?
答：抗原應(yīng)溶解在緩沖溶液(Tris， MOPS， Hepes)。不溶性抗原(包涵體)和可溶性的一樣好。理想的抗原濃度是1mg/ml，然而較低濃度也可以接受的。
您也可以把含有目標蛋白的 SDS-PAGE膠發(fā)給我們，將膠放于水中變脫色，因為醋酸能使得蛋白質(zhì)進一步地變性。
避免：對動物有毒的添加劑，如蛋白酶抑制劑如PMSF、疊氮化鈉等等�？山邮埽旱土康腟DS、咪唑、尿素、胍，非離子型去污劑，EDTA或EGTA和聚丙烯酰胺。添加的最終的量在很大程度上取決于樣本體積/抗原濃度。請查詢。

9. 問：選擇哪個物種用于免疫接種?
答：使用IgG (兔、山羊)和IgY(雞)抗體針對同一抗原的優(yōu)勢：
----獨立確認預(yù)期的目標蛋白質(zhì)被檢測。
——抗體庫具有不同的特性，在不同的技術(shù)中能起到互補的作用(免疫印跡、免疫沉淀反應(yīng)等)雙重染色。
----一般從遺傳角度上選擇與抗原有較遠的親源關(guān)系的物種用于免疫接種 (如母雞非常適合生產(chǎn)保守序列的哺乳動物蛋白質(zhì))。找到更多關(guān)于IgY信息。

10. 問：在我開始實驗前可以測試來源于一些動物的免疫前血清或卵黃嗎?
答：按照您的要求，在您開始您的實驗前Agrisera會送你幾個免疫前血清或卵黃樣品。您可以選擇具有最低背景信號的動物用于測試。

11. 問：在兔子中生產(chǎn)的抗體比那些在雞中生產(chǎn)的更好嗎?
12. 答：生產(chǎn)抗體的過程是抗原，特異動物免疫反應(yīng)和測試的結(jié)合。如哺乳動物的保守靶標蛋白，我們推薦使用在雞中生產(chǎn)的抗體。
因為他們在進化上親緣關(guān)系更遠，且他們的免疫系統(tǒng)與保守的哺乳動物蛋白反應(yīng)更好，而這些保守哺乳動物蛋白可能不會被山羊或兔子的免疫系統(tǒng)識別。

13. 問：我定制了一個抗體。我怎么知道定做的抗體能識別正確的蛋白質(zhì)?
答：首先用間接的ELISA分析做確認，ELISA板上用動物免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽包被，把血清加入板中孵育，隨后二抗發(fā)出信號。這是第一個證據(jù)能說明免疫動物產(chǎn)生的抗體能識別目標蛋白或肽。然而，這個結(jié)果可能與在自然組織中檢測到的水平不直接對應(yīng)。ELISA板上包被了很好的暴露的多肽或蛋白質(zhì)，在只含有少數(shù)細胞的自然組織蛋白中可能不會發(fā)生。因此，測試包括收集已知或我們猜測能正確表達目標蛋白的材料。另外也包括以缺失或過表達突變體提取物為對照的測試。在免疫印跡中使用重組蛋白作為對照，可能會為我們提供一些信息，但在某些情況下， 產(chǎn)生的抗體只識別重組蛋白而不識別天然的蛋白質(zhì)。另一個風險是，我們的膜暴露的時間太短，使得只能顯示出重組蛋白的信號�？紤]特定組織的表達水平，遵循一定的發(fā)展模式，有些蛋白質(zhì)難以檢測。為了測試的成功所有這些因素都必須考慮在內(nèi)。
14. 問：如果我的抗體在免疫定位試驗中成功了，是否該抗體在免疫印跡和其它的試驗中也能用呢?
答：再次強調(diào)，它取決于抗體識別蛋白質(zhì)的哪一部分和在固定后或免疫印跡后蛋白的哪一部分暴露了。如果多克隆抗體是合成肽，它能識別抗原池，如果這類抗原固定后沒有暴露----抗體將不會識別抗原。在某些情況下在緩沖液中加入6 - 8 M尿素有助于蛋白質(zhì)的暴露。   
15. 問： 可以獲得多少血清或雞蛋?
答：山羊：200毫升血清/月
兔子：50毫升血清/月
母雞： 25個蛋/每月
16. 問：如何儲存抗體？
答：血清中的抗體，對于抗體這是一個非常穩(wěn)定的存儲形式。在-20°C或-70°C的血清通�？梢员４娑嗄�。在一些特殊的情況下， anti-peptide抗體儲存的時間更短。短時間可以儲存在4°C。在某些情況下操作要更加小心，第一步在-20°C冷凍，之后放于-70°C冷凍的效果更好。
總IgG片段（IgG蛋白經(jīng)過蛋白G基質(zhì)純化后），一般抗體以這種形式是穩(wěn)定的。他們能夠儲存在-20°C或-70°C達數(shù)年之久。對于短期使用時可加入疊氮化鈉（終濃度為0.02 %）或其他防腐劑。
總IgY片段（IgY抗體從卵黃中提取和純化的抗體），純化的IgY片段在室溫下時非常穩(wěn)定的（盡管我們不推薦室溫作為儲藏條件）。IgY能夠在含有0.02%的疊氮化鈉（注意：疊氮化鈉抑制HRP的活性）下或50 ug/ml硫酸慶大霉素的條件下儲存在4°C。要避免IgY凍融或儲存在干冰環(huán)境下，IgY能直接儲存在-20°C。
參考文獻："The IgY preparations were stable over time. No loss of antigen recognition was observed after storage for 3 years at + 4°C". F.De Ceunick et al. Journal of Immunological Methods 252 (2001) 153-161.
卵黃中的卵黃抗體需要在含0.02%疊氮化鈉（注意：疊氮化鈉抑制HRP的活性）或含50 ug/ml硫酸慶大霉素 的條件下儲存于4°C。卵黃不要冷凍儲藏，否則這會使得純化抗體非常困難，經(jīng)過6個月儲存后純化卵黃中的抗體將會變得更加的困難。

親和純化抗體：
最脆弱的抗體，應(yīng)該小心考慮存儲條件，實驗上檢查每一個抗體。針對不同抗原表位的親和純化抗體其穩(wěn)定性不同。有些會在純化后直接沉淀，活性仍然存在。對于一個給定的抗體很難提前預(yù)測儲存條件-----有一些可選的方案用于測試：
-20°C或-80°C
- 4°C+疊氮化防腐劑(0.02%)或硫柳汞
-20°C+甘油;甘油終濃度10或50%
-20°C+BSA終濃度為0.05 -0.5%
 IgG

哺乳動物，多克隆抗體親和純化后沉淀，可能直接沉淀或冷藏過夜后沉淀。一些抗原能夠刺激產(chǎn)生一類IgG，這被稱為冷球蛋白，意味著他們將在冷條件下沉淀。然而，加熱到室溫可以解決這個問題。抗體溶解后可以通過離心去除沉淀。
IgY
雞抗體也會在過夜冷凍儲存后或幾周后沉淀。加熱到室溫經(jīng)常幫助那些沉淀溶解。否則，使用前IgY溶液需要先經(jīng)過離心后去沉淀再使用。
抗體溶液無防腐劑儲存，有著被細菌污染的風險，這通常是最常見的蛋白質(zhì)失活的原因。

常規(guī)建議：
----對于較大體積的親和純化抗體，濾滅的抗體樣本和分成等份的液體避免多次凍融。
----存儲蛋白質(zhì)的濃度在0.5 - 1 mg/ml。
----檢查蛋白質(zhì)在不同儲存條件下的穩(wěn)定性，尤其是IgM。
重要提示：
疊氮化鈉將抑制辣根過氧化物酶的活性及干擾抑制一些耦合方法和生物測定。然而，在ELISA或WB實驗中制備IgY(含0.02%疊氮化鈉)作為一抗稀釋到1：2000倍時，疊氮化鈉的含量會因稀釋而不影響實驗。在抗體溶液中也可以選擇其它試劑來防止細菌生長：
----0.01%硫柳汞
----50微克/毫升硫酸慶大霉素  

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