Conn Carey¹ , Michelle Potter² , Luned Badder², Karl Morten²,, James Hynes¹
1 Luxcel Biosciences Ltd, Cork, Ireland
2 Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology, Uni. Oxford, Oxford, United Kingdom

要詳細(xì)了解腫瘤生物學(xué), 關(guān)鍵是知道氧氣量和代謝之間的相互作用關(guān)系。 盡管有充足可用的氧，腫瘤偏向缺氧代謝會(huì)導(dǎo)致糖酵解增加，也會(huì)引起轉(zhuǎn)錄反應(yīng)改變和遺傳不穩(wěn)定性，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。但是，由于缺乏有效的體外工具能夠測(cè)量這些參數(shù)，科研人員對(duì)氧氣量和關(guān)鍵的代謝指標(biāo)改變所知非常有限。

越來(lái)越多科研人員發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)條件是在高氧狀態(tài) （hyperoxic state）下進(jìn)行的。現(xiàn)在更多科學(xué)家希望采用跟生理狀態(tài)更接近的氧濃度進(jìn)行培養(yǎng)。 然而，控制環(huán)境氧濃度相對(duì)容易，但關(guān)鍵信息是細(xì)胞/組織的臨界氧濃度 (tissue oxygenation) 。在這里，我們向您推薦一種新型的熒光板閱讀器 (BMG Labtech Omega /ACU細(xì)胞專用讀板機(jī)) 配合Luxcel 公司新開(kāi)發(fā)的試劑盒，可以并行監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的氧氣濃度（MitoXpress-Intra）和糖酵酵解通量glycolytic Flux（pH-Xtra™）。

這種測(cè)量可以詳細(xì)了解細(xì)胞真實(shí)的含氧量及其所帶來(lái)的糖酵解活動(dòng)水平。 實(shí)驗(yàn)使用BMG Labtech Omega /ACU細(xì)胞專用讀板機(jī)配備大氣控制單元（ACU）進(jìn)行模擬腫瘤脫氧環(huán)境，數(shù)據(jù)揭示細(xì)胞單層和所在的環(huán)境氧氣濃度有著顯著差異，該差異在一般體外分析中是不太會(huì)注意到的。

測(cè)量原理是基于細(xì)胞內(nèi)吞MitoXpress Intra®氧氣探針，胞內(nèi)氧氣能淬滅探針?biāo)�發(fā)出的熒光信號(hào)。隨著細(xì)胞的呼吸作用，細(xì)胞內(nèi)的氧濃度降低甚至耗盡， MitroXpress Intra®探針?biāo)�發(fā)出的熒光信號(hào)，被淬滅的越來(lái)越少，熒光信號(hào)則相對(duì)越來(lái)越強(qiáng)。 通過(guò)比例測(cè)量時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度（Fig 1）。實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的分子氧瞬時(shí)變化，該系統(tǒng)也能對(duì)多個(gè)樣品的代謝活性瞬態(tài)變化進(jìn)行快捷的分析，跟傳統(tǒng)細(xì)胞外檢測(cè)方法比較，能提供更全面的缺氧研究參數(shù)。

此外，通過(guò)Luxcel pH-Xtra 探針測(cè)量（在平行井，或同一井）胞外酸化率 (ECA) ,可同時(shí)監(jiān)控細(xì)胞糖酵解通量 （glycolytic flux），評(píng)估細(xì)胞的能量潛力（Energy Budget）。數(shù)據(jù)顯示代謝中的細(xì)胞單層（或3維細(xì)胞團(tuán)）的氧濃度跟實(shí)驗(yàn)施加的氧氣濃度，有著顯著差別；特別是在生理相關(guān)的氧濃度，其影響更大，從而影響細(xì)胞的氧化磷酸化和糖酵解ATP通路平衡。

通過(guò)測(cè)量細(xì)胞單層內(nèi)的氧化率，可以評(píng)估一些細(xì)微短暫的代謝活動(dòng)變化，這是一般標(biāo)準(zhǔn)的胞外氧耗率測(cè)量做不到的。胞內(nèi)氧化率也允許評(píng)估特定激動(dòng)劑對(duì)代謝的詳細(xì)影響。樣本數(shù)據(jù)列于Fig2。

Fig 2.

Fig 2. 抗霉素 (Antimycin) 及FCCP對(duì)HEK293T細(xì)胞單層的氧化水平的影響�？姑顾厥且粋�(gè)ETC抑制劑，而FCCP則是ATP合成抑制劑。探針信號(hào)開(kāi)始時(shí)反映了穩(wěn)定態(tài)的氧水平，由于細(xì)胞消耗氧，所以這水平較環(huán)境氧水平低�？姑顾匾种蒲鯕庀�耗，導(dǎo)致氧彌散到單層并把濃度升回到周邊空氣中的含量。 FCCP導(dǎo)致增加氧氣消耗，所以細(xì)胞單層中的氧濃度迅速下降直到新的穩(wěn)定狀態(tài)。

Fig 3.

Fig 3.降低未經(jīng)處理（呼吸）和抗霉素處理（非呼吸）細(xì)胞周邊氧濃度并監(jiān)測(cè)單層氧的變化。通過(guò)Fig3 BMG Labtech Omega/ACU讀板機(jī)把氧濃度步退到21％至5％之間。MitoXpress® Intra 信號(hào)反映了細(xì)胞層實(shí)際的氧濃度。注：細(xì)胞呼吸驅(qū)使細(xì)胞單層的氧濃度比ACU設(shè)計(jì)的濃度更低，在低氧環(huán)境下其影響為更明顯。

Fig4.

Fig4. pH-XTRA：pH反應(yīng)(A)，原始數(shù)據(jù)輸出(B)，測(cè)量糖酵解抑制(C)
A）光學(xué)特性：經(jīng)同質(zhì)修正后pH探針的發(fā)射光譜在pH =7.5，7，6.5 及6。注意在pH值為7.5及6間信號(hào)增加7.5倍
B）原始數(shù)據(jù)輸出：Fig3列出梯度稀釋HepG2細(xì)胞濃度。增加細(xì)胞數(shù)量造成酸化率增加。％CV值 <5％顯示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的高重復(fù)性。
C）測(cè)量糖酵解抑制：加入2DG后因競(jìng)爭(zhēng)性抑制減少葡萄糖攝取。 處理后的細(xì)胞表現(xiàn)出戲劇性及即時(shí)性和對(duì)劑量依賴的胞外酸化率下降現(xiàn)象。

Fig 5. HepG2細(xì)胞經(jīng)抗霉素A (Antimycin A) 和草氨酸 (Oxamate) 處理后之pH-XTRA動(dòng)力學(xué)熒光信號(hào)(A) 和氫離子濃度(B)。Fig5C列出經(jīng)處理及沒(méi)處理之細(xì)胞有著明顯的酸化率差異。而Fig5D顯示低氧氣濃度對(duì)胞外酸化率的影響。

一）測(cè)量糖酵解抑制作用：經(jīng)草氨酸處理后乳酸脫氫酶 (LDH) 受到抑制，減少酸化�？姑顾靥幚砗蠹�(xì)胞增加糖酵解流量以維持ATP量，所以增加酸化率。
二）低氧增加Warburg 反應(yīng)：氧濃度從21％降低至6％，導(dǎo)致酸化率增加。

Fig 6. 測(cè)量HepG2 3D RAFT (TAP Biosystems)細(xì)胞結(jié)構(gòu)之胞內(nèi)氧氣量： 通過(guò)BMG Labtech Omega/ACU 細(xì)胞專用讀板機(jī) 調(diào)節(jié)周邊氧氣量在21 ％和1％之間 (A)，及跨越各種氧濃度下線粒體經(jīng)調(diào)節(jié)劑處理之反應(yīng)(B)。
（1）細(xì)胞供氧低于溶液中的氧：使用MitoXpress® Intra 測(cè)量細(xì)胞的氧含量，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)氧氣水平跟周邊水平（ACU水平）有著顯著分別 （A）。
（2）缺氧環(huán)境：溶液中的氧氣仍是約 3 ％，但細(xì)胞已出現(xiàn)缺氧呼吸（A） 。
（3） 測(cè)定線粒體毒性：抗霉素，魚(yú)藤酮 (Rontenone) 和FCCP處理后改變細(xì)胞的氧濃度，反映線粒體毒性。
注： MitoXpress®Intra 探針是在不同處理劑添加前16小時(shí)前添加的。該探針?lè)浅７�(wěn)定并可逆，可以在特定氧氣條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控（多個(gè)）藥物對(duì)細(xì)胞的影響。

Fig 7. 在周邊氧濃度為21％下使用MitoXpress®- Intra測(cè)量經(jīng)藥物處理后之HepG2 3D RAFT細(xì)胞團(tuán)氧含量之改變。
（1）藥品添加：加入線粒體解偶聯(lián)劑FCCP，引起3D RAFT細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)短暫但顯著的深化缺氧。

注： MitoXpress®Intra 探針?lè)浅７�(wěn)定并可逆，可以在特定氧氣控制條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控（多個(gè)）藥物對(duì)細(xì)胞的影響。不需要額外的化學(xué)程序。

通過(guò)使用胞內(nèi)氧（MitoXpress-Intra）和糖酵解通量（pH Xtra）試劑盒及BMG Omega/ACU 細(xì)胞專用讀板機(jī) （在平行井或同一井）允許方便地測(cè)量細(xì)胞能量潛力 (Energy Budget)，從而可對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行代謝圖譜探究。

雖然測(cè)量2D細(xì)胞單層培養(yǎng)也能得到非常多資料，但通過(guò)胞內(nèi)氧（MitoXpress-Intra）和糖酵解通量（pH Xtra）試劑盒及BMG Omega/ACU 細(xì)胞專用讀板機(jī)可以方便地測(cè)量3D 細(xì)胞團(tuán)的能量潛力，并提供了更多的更接近生理狀態(tài)下的細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)。例如利用球細(xì)胞團(tuán) （Spheroid）研究腫瘤生物學(xué)。Fig8顯示出從三個(gè)細(xì)胞系產(chǎn)生的球細(xì)胞團(tuán)的氧濃度。球細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的缺氧深度可能相當(dāng)大，缺氧程度跟細(xì)胞團(tuán)大小和代謝狀態(tài)相關(guān)。MitoXpress®Intra細(xì)胞穿透性染料允許測(cè)量整個(gè)球細(xì)胞團(tuán)的氧濃度*。

Fig 8.

Fig 8. 氧化細(xì)胞系產(chǎn)生的球細(xì)胞團(tuán)的胞內(nèi)氧氣量

代謝圖譜 ： 3個(gè)細(xì)胞系有著不同的胞內(nèi)氧氣量/呼吸需要。 RD 及New U87MG 均比環(huán)境氧氣量低。

MitoXpress® - Intra和pH- Xtra為測(cè)量細(xì)胞單層的氧氣量及細(xì)胞能量潛力提供了一個(gè)易于使用的解決方案。
兩個(gè)探針都是穩(wěn)定并可逆的，不需要額外的化學(xué)程序（不需礦物油層覆蓋細(xì)胞）。
MitoXpress® - Intra和pH- Xtra可以在平行井或同一井內(nèi)進(jìn)行使用，使用高端分辨熒光讀板機(jī)（BMG LABTECH FLUOstar Omega/ ACU）可進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。
這研究顯示在環(huán)境，培養(yǎng)液，及細(xì)胞層的氧氣量有著顯注的差異，- 所以顯出了測(cè)量細(xì)胞層內(nèi)氧氣濃度的重要性。 其效果在3D RAFT 細(xì)胞團(tuán)及球細(xì)胞團(tuán)中更顯著。
改變 “可用氧氣量” 可以顯著引起細(xì)胞代謝變化，其中包括糖酵解流量顯著增加。
MitoXpress® - Intra和pH- Xtra可提供高通量解決方案去衡量藥物在已知及控制的氧氣水平下對(duì)細(xì)胞代謝的影響。

材料與方法 ： 請(qǐng)參照原文