1.2 　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

　　4～6 周健康 BALB/ c 小鼠 40 只 ,雌雄不限 ,體重 16～20 g ,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將小鼠隨機(jī)分為兩組 ,A組為正常對(duì)照組 ,以生理鹽水代替雞卵清蛋白 (Ovalbumin ,OVA , Grade Ⅱ, Sigma 公司) 致敏和激發(fā)小鼠 ;B 組為致敏模型組 ,給予 OVA致敏和激發(fā)。

1.3 　致敏小鼠模型的建立

分別于第 1 天、第 13 天經(jīng)小鼠腹腔注射 OVA 10μg 和氫氧化鋁凝膠(Al(OH)3)20 mg混合液;第 25 天時(shí) ,將每只小鼠單獨(dú)置于 5 L 密閉容器中 ,以 1 % OVA 進(jìn)行霧化吸入激發(fā) ,使小鼠暴露在 OVA 氣霧中 20～30 min 直至出現(xiàn)哮喘樣發(fā)作為止 ,持續(xù) 6 d。由 402 型超聲霧化器(上海合力醫(yī)用器械廠)提供霧化動(dòng)力。

1.4 　外周血、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage

fluid ,BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞百分比 (percentages

of eosinophils ,EOS %)計(jì)數(shù)及肺組織標(biāo)本留取

1.4.1 　外周血及 BALF中 EOS%計(jì)數(shù) 　　各組小鼠各 14 只最

后一次激發(fā) 24 h 后 ,經(jīng)腹腔麻醉 ,行氣管切開(kāi) ,收集 BALF 5ml ,

針刺心臟取血約 0. 5～0. 8 ml。將全部液體離心 ,收集沉淀細(xì)

胞 ,加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。用 EOS 計(jì)數(shù)液行 EOS 計(jì)

數(shù)。

1.4.2 　肺組織標(biāo)本留取 　　打開(kāi)未經(jīng)支氣管肺泡灌洗的各組各 6 只小鼠胸腔 ,觀察肺臟的大體改變 ,剪取部分肺組織 ,經(jīng)10 %甲醛固定后切片 ,行 HE染色。

1.5 　CD4+T細(xì)胞的分離及鑒定

1.5.1 　CD4+T細(xì)胞的分離 　　打開(kāi)小鼠腹腔 ,無(wú)菌取出脾臟放入冷 Hanks液中 ,將其捻碎并濾過(guò) 100 目無(wú)菌鋼網(wǎng) ,收集脾細(xì)胞懸液加入到淋巴細(xì)胞分離液中 ,2 000 g 離心 30 min ,沿管壁輕輕吸出中間灰白色細(xì)胞層 ,重懸于含 10 % FCS的 RPMI 1640溶液中 ;按每 1 ×108個(gè)細(xì)胞加入尼龍毛柱中 ,37 ℃,5 %CO2孵箱中孵育 1 h;打開(kāi)下端出口 ,使 T細(xì)胞懸液以 40～60 滴(Drop ,d)/ min 流出 ,用 RPMI 1640 溶液反復(fù)洗柱至洗脫液達(dá) 6～8 ml ,將細(xì)胞懸液按每 1 ×107個(gè)加入 CD8+mAb 包被的聚苯乙烯平皿中 ,并加入 RPMI 1640 溶液 2 ml ,混勻 ,4 ℃作用 70 min ,每 20 分鐘輕輕旋搖 1 次 ,沿平皿壁吸取細(xì)胞懸液并用 RPMI 1640 溶液輕洗 2 次 ,2 000 g離心 10 min ,收集的細(xì)胞懸液即 CD4+T細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù) ,細(xì)胞存活率 > 89 %。

1.5.2 　CD4+T細(xì)胞純度鑒定 　　采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytom2etry ,FCM)鑒定 CD4+T細(xì)胞純度[1]。

1.6 　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析        各組結(jié)果以 ?x ±s 表示 ,各組間比較采用非配對(duì) t 檢驗(yàn)。

2 　結(jié)果

2.1 　小鼠致敏模型的肺組織病理改變      致敏組小鼠的肺臟與正常對(duì)照組小鼠的肺臟相比體積明顯增大 ,表面腫脹 ,有多處形狀不規(guī)則的暗紅色充血區(qū)。切面有白色泡沫狀滲出物 ,并可見(jiàn)明顯的血管斷面。肺組織切片HE 染色可見(jiàn)支氣管及血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn) ,以EOS為主 ,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)也可見(jiàn) EOS浸潤(rùn)。細(xì)小的支氣管內(nèi)可見(jiàn)粘液栓。氣道上皮多處斷裂 ,基底膜明顯增厚且形態(tài)不規(guī)則。細(xì)支氣管平滑肌發(fā)生肥厚性增生。

2.2 　外周血及 BALF中 EOS %

2.2.1 　外周血 EOS%　　致敏組小鼠外周血 EOS%(11. 0 ±2.7)與正常對(duì)照組(0.7 ±0.5)比較顯著增高( P < 0.01) 。

2.2.2 　BALF中 EOS%　　正常對(duì)照組小鼠 BALF 中幾乎沒(méi)有EOS(0.0 ±0.01) ,致敏組小鼠 BALF 中 EOS%(21. 9 ±4. 4) 與正常對(duì)照組比較顯著升高( P < 0.01) 。

2.3 　CD4+T細(xì)胞純度鑒定結(jié)果

經(jīng) FCM檢測(cè) ,CD4+T細(xì)胞的純度為 97.3 % ,見(jiàn)圖 1。

圖 1 　FCM檢測(cè) CD4+T細(xì)胞純度

3 　討論

　　本實(shí)驗(yàn)建立的 BALB/ c 小鼠致敏模型病理表現(xiàn)為:肺臟明顯水腫 ,細(xì)、小支氣管內(nèi)有多量的粘液栓 ,氣道上皮斷裂、脫落 ,基底膜增厚 ,支氣管及肺血管周圍有以 EOS為主的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn) ,與哮喘的病理學(xué)特點(diǎn)相似 ;同時(shí) ,此模型小鼠外周血及 BALF中 EOS %顯著增加 ,與哮喘患者外周血及 BALF 中 EOS %的改變一致 ,說(shuō)明此模型可用于哮喘的實(shí)驗(yàn)研究。

　　Panning 法又稱洗淘法。它是運(yùn)用抗原與抗體相結(jié)合的原理進(jìn)行細(xì)胞分離的一種方法 ,具有簡(jiǎn)便 ,經(jīng)濟(jì)、細(xì)胞完整性好等特點(diǎn)。國(guó)外在 90 年代早、中期即將這種方法廣泛用于實(shí)驗(yàn)中。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步 ,目前國(guó)外用于分離細(xì)胞的方法主要是磁珠分離法[2]和流式細(xì)胞儀法[3],但其造價(jià)昂貴 ,在國(guó)內(nèi)并不能

普遍開(kāi)展 ,故運(yùn)用 Panning 法分離細(xì)胞仍不失為一種高效、經(jīng)濟(jì)的方法。本實(shí)驗(yàn)用 Panning 法分離的 CD4+T細(xì)胞經(jīng) FCM檢測(cè) ,純度高 ,完全可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

　　關(guān)鍵詞 : 哮喘 ;模型 ;小鼠 ;CD4+T細(xì)胞

中圖法分類號(hào) : R - 332;R562.25 　　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 : B

參考文獻(xiàn) :

[1] 沈關(guān)心 ,周汝麟. 現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社 , 1998.180 - 183.

[2] Holmes B J , MacAry P A , Noble A , et al. Antigen2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin24 production by CD4+Tcells[J ]. EurJ Immunol ,1997 ,27(10) :2 657 - 2 665.

[3] Denkers E Y, Scharton2Kersten T, Barbieri S, et al. A role for CD4+NK1.1 + T lymphocytes as major histocompatibility complex class Ⅱinde2pendent helper cells in the generation of CD8+effectorsfunction against in2tercellular infection[J ]. J Exp Med ,1996 , 184(1) : 131 - 139.

(編輯 　陳聰連)