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多功能酶標(biāo)儀的新發(fā)展 -濾光片和光柵以外的新濾光技術(shù)!

瀏覽次數(shù):7546 發(fā)布日期:2013-12-2  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

多功能酶標(biāo)儀是現(xiàn)今生物技術(shù)和研究中不可缺少的工具。隨著高通量檢測和微孔板技術(shù)的日漸成熟,多功能酶標(biāo)儀已漸漸成為現(xiàn)今實(shí)驗(yàn)室必備的系統(tǒng)。市場上有很多多功能酶標(biāo)儀的廠家,可謂百花齊放。消費(fèi)者往往會花多眼亂,很難取舍。其實(shí),現(xiàn)今的酶標(biāo)儀主要有兩種光學(xué)技術(shù):一種是利用濾光片技術(shù);另一種是光柵技術(shù)。 前者的技術(shù)發(fā)展比較早,后者則是較近期的技術(shù)。但是兩者其實(shí)各有好處,可以互補(bǔ)不足。而不論是哪種技術(shù),選擇酶標(biāo)儀的第一原則是選擇有最好的信噪比(Signal to Noise Ratio, SNR)。

 

濾光片原理:

濾光片是玻璃片再加入特定的染料制成的。當(dāng)加入染料后,濾片的分子結(jié)構(gòu)和折射率發(fā)生了變化,使濾光片對某些色光(也就是波長)的通過有了變化。例如一個(gè)480/20nm的濾光片可以讓470nm490nm波長的光通過,在這個(gè)波長范圍以外的光就會被擋住和吸收。在酶標(biāo)儀內(nèi),光源會從氙燈或鹵鎢燈發(fā)出,通過特定的濾片,把不需要的波長隔開,然后再照射到樣本中。樣本中的熒光染料會被激發(fā),放出發(fā)射光,再透過特定的濾片把雜光隔開,然后被檢測器收集。這就是濾光片系統(tǒng)酶標(biāo)儀的熒光檢測過程。
 

濾光片的好處:

濾光片具有非常好的透光率 (可高于90%),也就是說光能量的損失比較少。如下圖(圖1),在一個(gè)熒光檢測中,經(jīng)過濾光片進(jìn)入樣本的激發(fā)光和從樣本透過濾光片進(jìn)入檢測器的發(fā)射光都只有少量的損失(大約10%)。光的損失較少,光的能量自然較大,熒光的信號自然很容易檢測。這是獲得高信噪比(SNR)的最初始保證。

所以,由于有高的信噪比(SNR)保證,濾光片系統(tǒng)從酶標(biāo)儀誕生以來一直就是高靈敏度檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)。我們也不難發(fā)現(xiàn)很多有光柵型酶標(biāo)儀的廠家在一些檢測靈敏度要求比較高的高端應(yīng)用(如:TRF、TR-FRET、等)中,都會有另外配上濾光片模塊的設(shè)計(jì)。因?yàn)檫@些高端的應(yīng)用,光柵系統(tǒng)未能有滿意的效果或干脆做不到。

 

濾光片的缺點(diǎn):

當(dāng)然,濾光片也有其缺點(diǎn)。當(dāng)檢測不同波長的熒光染料時(shí)便要用不同的濾光片。市面上大部份濾光片型酶標(biāo)儀都可配有4-8對濾片以應(yīng)付不同波長檢測的要求,當(dāng)特別的波長沒有濾片時(shí),使用者便要另行購買,然后人手更換。有些使用者可能會覺得不太方便。濾光片系統(tǒng)的另一個(gè)問題是不能夠做波長掃描,如果使用者想對樣本作波長掃描尋找其光譜特性,那么濾光片系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)。
 

光柵的原理:

為解決濾光片系統(tǒng)不可隨時(shí)改變波長的問題,光柵型酶標(biāo)儀就應(yīng)運(yùn)而生。它是使用物理性衍射光柵原理在不同的角度把白光光源分開成獨(dú)立的波長,之后再經(jīng)過一系列的狹縫把已選取的激發(fā)波長分出來,并照射到樣本上。樣本的發(fā)射光也被同樣的原理去分隔出需要的波長,最后被檢測器接收和量度。

 

光柵的好處:

光柵系統(tǒng)的好處就是可隨意選擇波長和進(jìn)行波長掃描,這方便了使用者,F(xiàn)今大部份的研究單位都設(shè)有公用平臺,把一些高端的儀器集中一起管理,高端的多功能酶標(biāo)儀也是其中之一。光柵型的多功能酶標(biāo)儀在公用平臺中為使用者提供了便利,因不需更換和保管濾光片,在儀器管理的層面也比較簡單。
 

光柵的缺點(diǎn):

雖然光柵系統(tǒng)帶來方便,但也有一些致命缺點(diǎn)。首先,基于光路設(shè)計(jì)的問題,光柵的光能損失比濾片大很多。如下圖(圖2),在熒光檢測中,光源經(jīng)過光柵而成的激發(fā)光已比原來的少了大概70%的能量。樣本被激發(fā)后會放出發(fā)射光,發(fā)射光會透過光柵去分隔出需要的波長。被分隔后的發(fā)射光能量再損失了70%。假設(shè)熒光被激發(fā)的效率為50%,那么可以進(jìn)入檢測器被檢測的光只有原來光源的 4.5% !! 這就是為什么光柵酶標(biāo)儀的

敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有濾光片酶標(biāo)儀好的原因,也正因?yàn)檫@個(gè)原因,在高端光柵型的酶標(biāo)儀也要配備濾光片模塊才能進(jìn)行TRF、TR-FRET等高靈敏度需求的檢測。

 
除了光能量秏損較大外,光柵系統(tǒng)的另一個(gè)問題是波長帶寬狹窄。市面上的光柵系統(tǒng)的波長帶寬一般為10nm,有些系統(tǒng)可把帶寬調(diào)至15nm來增加靈敏度。如果要檢測480nm的波峰,光柵系統(tǒng)的激發(fā)波長范圍大概為475nm-485nm左右。如果只是要檢測單一波峰是可以的,但是大部份熒光探針的激發(fā)和發(fā)射
光都不是單一波長,而是一個(gè)波長范圍。例如圖3為常見的熒光染料激發(fā)光和發(fā)射光光譜,可見無論是激發(fā)和發(fā)射都是一個(gè)波段,并非單一波峰。
如果在光柵系統(tǒng)下,基于帶寬的限制,它只能選用激發(fā)和發(fā)射的最高效率的波長去做檢測。相反,在濾光片系統(tǒng)的情況下,使用者可按需要采用帶寬較大的濾片,例如:480/40nm,去做激發(fā)和發(fā)射光檢測。這樣,可用的激發(fā)和發(fā)射光波段便會大大增加了,見圖4。由于可用的波段較寬,用來激發(fā)和
被檢測的發(fā)射光也較多,所以光能也自然較大。另外一個(gè)例子是:當(dāng)進(jìn)行TRF、TR-FRET這類高端應(yīng)用時(shí),由于激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的距離非常遠(yuǎn)(圖5Eu的激發(fā)/發(fā)射光譜圖),這種情況下,濾光片系統(tǒng)可以非常方便的選擇可產(chǎn)生最高信噪比的濾光片組合(盡可能寬的帶寬,比如40nm甚至更大)以獲得最大的信噪比。而由于光柵系統(tǒng)自身固有的缺陷(帶寬小、濾光效率低),
其獲得的信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法跟濾光片型酶標(biāo)儀相媲美。
光柵系統(tǒng)還有另外一個(gè)問題,就是過濾出來的波長會有偽尾的出現(xiàn)。偽尾就是指在選定的波長以外,但與被選的波長很接近的雜光透過光柵進(jìn)入了樣本和檢
測器。這一些雜光的出現(xiàn),再加上背景噪音訊號會使儀器的靈敏度受到限制,使其很難去檢測一些很弱的熒光訊。光柵型酶標(biāo)儀解決偽尾的方法是增加一個(gè)Cutoff濾光片進(jìn)一步濾光;另一個(gè)方法是再加一級光柵(雙光柵系統(tǒng)),導(dǎo)致濾光效率也進(jìn)一步降低。
 

集兩家之長?

鑒于市場上開始意識到光柵和濾光片的問題,于是一些酶標(biāo)儀廠家推出了一些稱為混合型 (Hybrid Technology)的型號。這些混合型系統(tǒng)配有濾光片和光柵兩種光路,用戶可以按需要選擇其一去做檢測。這種概念聽起來是不錯(cuò),可是實(shí)際上混合型的酶標(biāo)儀并沒有解決濾光片和光柵互有缺點(diǎn)的問題。它只是把兩種技術(shù)放在一起,供使用者選擇,每種技術(shù)本身的問題仍然存在。這種儀器的賣點(diǎn)似是市場推廣的手法較真正解決問題為多。

 
·真正的決解方案—線性漸變?yōu)V光片(LVF)技術(shù)  
 
要真正集兩家之長,就是要使酶標(biāo)儀能擁有濾光片的高信噪比同時(shí)也擁有光柵的靈活

性。德國專業(yè)酶標(biāo)儀廠家BMG Labtech剛在今年七月推出了突破性的新技術(shù)—線性漸變?yōu)V光片(LVF)技術(shù)。這個(gè)技術(shù)利用漸變?yōu)V光片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了光柵的功能,且同時(shí)保證了濾光片本身的高信噪比特性。LVF系統(tǒng)既可以隨意挑選波長和進(jìn)行波長掃描。更具突破性的是,LVF技術(shù)完全克服了傳統(tǒng)光柵帶寬選擇的局限性,可按實(shí)驗(yàn)需在8nm-100nm之間選擇任意帶寬(0.1nm遞進(jìn))!也就是說LVF集合了濾光片的高信噪比、更大彈性帶寬選擇的優(yōu)點(diǎn)和傳統(tǒng)光柵波長選擇和波長掃描等所有優(yōu)點(diǎn),諸多優(yōu)點(diǎn)的有機(jī)結(jié)合造就了新一代的多功能酶標(biāo)儀——LVF酶標(biāo)儀。

 

現(xiàn)在,LVF酶標(biāo)儀的使用者可以利用LVF技術(shù)像傳統(tǒng)光柵酶標(biāo)儀一樣去自由制定任意波長的濾光片。LVF酶標(biāo)儀與傳統(tǒng)濾光片酶標(biāo)儀相比較,在普通熒光檢測、TRF、TR-FRET等高端領(lǐng)域檢測效果與濾光片系統(tǒng)酶標(biāo)儀同樣出色!LVF技術(shù)是市場上唯一可以改變波長和帶寬的濾光片/光柵,這種特破性的設(shè)計(jì)使LVF酶標(biāo)儀可完成任何波長、任何帶寬、任何檢測的完美檢測!

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