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PCR技術(shù)專(zhuān)題：差示反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)

瀏覽次數(shù)：1254　發(fā)布日期：2013-11-25　來(lái)源：上海北諾生物科技有限公司

差示反轉(zhuǎn)錄PCR也稱(chēng)為mRNA差異顯示技術(shù)，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時(shí)檢測(cè)兩種或兩種以上經(jīng)不同處理或處于不同發(fā)育階段的樣品，該方法自問(wèn)世以來(lái)已被廣泛用于差異表達(dá)基因的克隆鑒定研究中。

實(shí)驗(yàn)方法

mRNA差異顯示法
熒光標(biāo)記法

實(shí)驗(yàn)方法原理	幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說(shuō)的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結(jié)構(gòu)的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點(diǎn)堿基之前的一個(gè)堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)特征，P.Peng等人設(shè)計(jì)合成三中不同的下游引物，它由11個(gè)或12個(gè)連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個(gè)3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類(lèi)人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上分成三個(gè)亞群體。然后用一個(gè)上游的隨機(jī)引物和與反轉(zhuǎn)錄時(shí)相同的oligo(dT)引物對(duì)這個(gè)cDNA亞群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因?yàn)檫@個(gè)上游的引物將隨機(jī)結(jié)合在cDNA上 ,因此來(lái)自不同mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是不同的，可以在測(cè)序膠上明顯分辨開(kāi)來(lái)，從而篩選出不同樣品間基因差異表達(dá)的DNA片段。
實(shí)驗(yàn)材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗(yàn)步驟	一、實(shí)驗(yàn)材料 1. 紅豆杉細(xì)胞未經(jīng)MJ誘導(dǎo)處理的A和經(jīng)MJ誘導(dǎo)處理的B紅豆杉細(xì)胞。 2. 寡核苷酸引物（1）3’錨定引物： ①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’ （2）5’ 隨機(jī)引物： Kit引物： ①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ ④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ ⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ ⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ ⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ ⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3’ 生工引物： ①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTCATTCCG-3’ ②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCCACGTA-3’ ③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’ ④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’ ⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTCGGCATA-3’ ⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’ ⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTACGCAAC-3’ ⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’ 特異引物： ①5ac： 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’ ②ck5： 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’ ③10ac： 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’ ④10acb： 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’ ⑤2ben： 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’ ⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’ ⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’ 二、實(shí)驗(yàn)方法 2. 總RNA的提取與檢測(cè) （1）用品的準(zhǔn)備塑料器皿，如離心管、Tip頭等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時(shí)以上，高壓滅菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小時(shí)以上，高壓滅菌后4℃保存；玻璃器皿經(jīng)180℃烘烤12小時(shí)以上，冷卻備用。（2）試劑的配置 ① CSB緩沖液 42 mmol/L 檸檬酸鈉（Sodum citrate） 0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸鈉（N-lauryl sarcosine） 0.2 mmol/L 巰基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）（3）RNA提取對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞A、B進(jìn)行RNA提取，提取步驟如下： ① 50 ml 離心管中加入10 ml 變性勻漿液，冰浴5分鐘。 ② 取0.5 g 細(xì)胞在液氮中研磨至粉末，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的變性勻漿液中，加200 ul β-巰基乙醇，振蕩混勻。 ③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸鈉（pH4.0），充分混合。 ④ 加入10 ml 水飽和酚，劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置5分鐘。 ⑤ 加入2 ml 氯仿：異戊醇（24：1），劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置15分鐘。 ⑥ 4℃，12 000 g，離心20分鐘。 ⑦ 小心移取上層水相，棄去中間相和下層有機(jī)相。 ⑧ 加入6 ml 水飽和酚，劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置5分鐘。 ⑨ 加入6 ml 氯仿：異戊醇（24：1），劇烈振蕩10~15秒，在冰上放置15分鐘

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