一、實驗目的

學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法——脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

二、實驗原理

上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。

外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。

利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

上圖是本次實驗采用的脂質體中陽離子組分的結構的示意圖。

本次實驗采用的脂質體是promega公司的TransFast脂質體試劑，它是一種陽離子脂質體和中性脂質體的混合物，是對于本次實驗中采用的293T細胞優(yōu)化的轉染試劑。

三、實驗材料與器材

1、材料

293T細胞
MyoD表達質粒和EGFP表達質粒
DMEM培養(yǎng)基
鏈霉素/青霉素（雙抗）
FCS（小牛血清）
PBS（磷酸鹽緩沖溶液）
胰酶/EDTA消化液
轉染試劑（TransFast）

2、器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭
酒精燈
廢液缸
血球計數(shù)板
渦旋振蕩器
恒溫水浴箱
臺式離心機
35mm培養(yǎng)皿
轉染管
15ml離心管
觀察用倒置顯微鏡
熒光顯微鏡和CCD

四、 實驗步驟

1、細胞傳代

（1） 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。

（2） 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

（3） 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘（37℃，5%CO₂ ）。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。

（4） 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。

（5） 用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。

（6） 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

（7） 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X10⁶個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。

（8） 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

（9） 將培養(yǎng)皿轉入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。

2、細胞轉染

（1）轉染試劑的準備

A. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩，。

（2） 選擇合適的混合比例（1：1-1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

（3） 將混合液在室溫放置10-15分鐘。

（4）  吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

（5） 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

（6） 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。

3、第二次細胞傳代

（1） 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

（2） 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X10⁵個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新粉入培養(yǎng)皿中。

（3） 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。

轉染條件優(yōu)化可以參考TransFast的使用說明書。