均相高通量方法在活細(xì)胞GPCR功能性和表面受體結(jié)合試驗(yàn)中的研究

介紹：

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是目前已知細(xì)胞表面受體家族中最大的一個(gè)分支，目前的藥物篩選中有40%是針對(duì)GPCR進(jìn)行的。先導(dǎo)化合物的篩選過(guò)程中，首先要針對(duì)這些潛在藥物（化合物）進(jìn)行療效的評(píng)估（例如在心血管疾病及其它領(lǐng)域），如果想充分了解這些候選藥物的作用機(jī)制，如受體和配體結(jié)合、受體聚集或者受體內(nèi)化等，都需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)。因此，我們需要建立一個(gè)適合高通量篩選工作的高自動(dòng)化及高靈敏度的試驗(yàn)方法。Tag-lite細(xì)胞篩選平臺(tái)設(shè)計(jì)初衷即是為了提高細(xì)胞表面受體研究的靈活性。此平臺(tái)可針對(duì)藥理特性研究和研發(fā)治療性抗體設(shè)計(jì)出各種各樣不同的試驗(yàn)方案，非常適合進(jìn)行大量初篩和復(fù)篩工作。這里我們展現(xiàn)出的結(jié)果是利用了Tag-lite受體配體結(jié)合試驗(yàn)平臺(tái)及SpectraMax® Paradigm 微孔板讀板機(jī)進(jìn)行的GPCR激動(dòng)劑和拮抗劑研究，其中包括了多巴胺D3、胰高血糖素GLP1和Mu阿片試驗(yàn)。衡量試驗(yàn)的關(guān)鍵性指標(biāo)是Z值和窗口值，同時(shí)我們也給出了其針對(duì)cAMP、pERK和pAKT的試驗(yàn)結(jié)果。

方法：

TR-FRET檢測(cè)的原理

HTRF技術(shù)（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是基于TR-FRET技術(shù)（即結(jié)合了TRF和FRET兩種技術(shù)）的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。HTRF供體熒光染料分子采用了銪元素（Eu3+ cryptate）或Lumi4®-鋱?jiān)�素�?/SPAN>Tb2+ cryptate）的穴狀化合物，是與Lumiphore公司近期合作成果。很多種受體分子都能作為紅色或者綠色熒光的發(fā)射體。當(dāng)用兩種熒光染料分子標(biāo)記生物分子相互作用后，通過(guò)對(duì)穴狀化合物標(biāo)記的供體分子被激發(fā)后，其一部分能量由受體熒光染料分子所捕獲。下圖展示出了TR-FRET在使用Eu3+穴狀化合物作為供體分子和XL665作為受體分子的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)流程和檢測(cè)原理。

結(jié)果和討論：

Tag-lite 活細(xì)胞GPCR結(jié)合試驗(yàn)

Tag-lite檢測(cè)平臺(tái)使用HTRF染料分子標(biāo)記你感興趣蛋白質(zhì)的靶點(diǎn)。Cisbio公司生物檢測(cè)系統(tǒng)可提供編碼TAGs標(biāo)簽和感興趣的蛋白序列的質(zhì)粒，或者是已構(gòu)建好質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的凍存細(xì)胞。當(dāng)受體的配體（激動(dòng)劑或拮抗劑）與受體結(jié)合后，構(gòu)建表達(dá)標(biāo)簽的蛋白就可以被鋱元素的穴狀化合物所標(biāo)記。Tag-lite檢測(cè)技術(shù)是一個(gè)應(yīng)用廣泛的、理想的檢測(cè)平臺(tái)，可用于機(jī)制研究、受體二聚化、配體結(jié)合、第二信使檢測(cè)等試驗(yàn)。

圖一：Tag-lite細(xì)胞表面結(jié)合試驗(yàn)原理

cAMP檢測(cè)試驗(yàn)

cAMP檢測(cè)試劑盒采用HTRF技術(shù)，可以直接從懸浮細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞中對(duì)cAMP含量進(jìn)行檢測(cè)。我們采用標(biāo)記了銪元素（Eu3+ cryptate）的抗cAMP的單克隆抗體作為示蹤分子，免疫競(jìng)爭(zhēng)方法分析細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的cAMP和標(biāo)記有d2熒光染料分子的cAMP標(biāo)品，為了評(píng)價(jià)SpectraMax Paradigm 和 M5e多功能讀板機(jī)在此類(lèi)試驗(yàn)中的表現(xiàn)而做的滴度曲線(xiàn)，如下圖所示。

圖二： SpectraMax Paradigm 和SpectraMax M5e多功能讀板機(jī)，針對(duì)cAMP濃度滴度曲線(xiàn)評(píng)價(jià)：W =21.4, Z’ = 0.91 . M5e: W = 15.5, Z’ = 0.97

HTRF細(xì)胞激酶試劑盒來(lái)檢測(cè)pAKT和pERK含量

Cellul'erk為基于HTRF技術(shù)的檢測(cè)試劑方法，可用于磷酸化AKT（Ser473）含量的檢測(cè)，此試劑可直接在完整細(xì)胞中檢測(cè)活化的ERK1/2和AKT。當(dāng)受體被刺激后，引發(fā)了相關(guān)激酶的活化，通過(guò)該試劑盒就可檢測(cè)到細(xì)胞裂解液中磷酸化蛋白的含量。磷酸化蛋白的測(cè)量應(yīng)用了雙抗體夾心法，兩個(gè)抗體均為單克隆抗體。其中一個(gè)為抗磷酸化蛋白的抗體，標(biāo)記Eu3+；另一個(gè)為抗蛋白其它位點(diǎn)的抗體，標(biāo)記d2。

圖三：刺激后和未刺激的細(xì)胞裂解液作為試驗(yàn)的內(nèi)部質(zhì)控條件，來(lái)檢測(cè)獲得結(jié)果的質(zhì)量，窗口顯示為高低兩個(gè)質(zhì)控

多巴胺D-3結(jié)合試驗(yàn)

多巴胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，主要分布于脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，多巴胺受體與許多神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程有關(guān)，包括興奮、認(rèn)知、記憶和小肌肉發(fā)育等，如果多巴胺受體信號(hào)傳導(dǎo)異常能夠引起神經(jīng)系統(tǒng)障礙，因此多巴胺受體是常見(jiàn)測(cè)神經(jīng)性藥物的作用靶點(diǎn)�？咕�神病藥物是多巴胺受體的拮抗劑，而精神興奮劑通常是多巴胺受體激動(dòng)劑。多巴胺D3基于細(xì)胞Tag-lite結(jié)合試驗(yàn)，方便檢測(cè)其激動(dòng)劑和拮抗劑，開(kāi)發(fā)全新的抗精神病藥物。

圖四：結(jié)合試驗(yàn)：HEK293細(xì)胞表達(dá)D3受體標(biāo)記了Tb穴狀化合物，然后受體與配體結(jié)合孵育90分鐘，在兩款儀器上分別設(shè)置不同的延遲和檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)時(shí)間越短會(huì)加大W和Z’值。

Delay – 20s; Int – 200s
Delay – 20s; Int – 500s

我們分別用SpectraMax Paradigm 和 SpectraMax M5e兩款多功能讀板機(jī)優(yōu)化設(shè)置后，評(píng)估多巴胺D3 Tag-lite結(jié)合試驗(yàn)的表現(xiàn)，兩歀儀器在競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)的表現(xiàn)結(jié)果如下。Paradigm即得出了理想的結(jié)果也表選出了無(wú)與倫比的便利性，用戶(hù)可以更具需要隨時(shí)通過(guò)購(gòu)買(mǎi)優(yōu)化卡盒來(lái)升級(jí)系統(tǒng)滿(mǎn)足未來(lái)的需要。

圖五：競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，檢測(cè)幾個(gè)未知的多巴胺受體的激動(dòng)劑和拮抗劑，并得出IC50s值。細(xì)胞孵育在6nM受體配體結(jié)合體系中以及一個(gè)受體激動(dòng)劑PPHT和溴麥角環(huán)肽或拮抗劑NAPS,兩款儀器得出相似的IC50s值。

優(yōu)化SpectraMax Paradigm 和 SpectraMax M5e兩款儀器的設(shè)置

通過(guò)修改延遲時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩臺(tái)儀器都縮短了延遲時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間會(huì)獲得更大的窗口值。

圖六：使用SpectraMax Paradigm儀器設(shè)置不同檢測(cè)時(shí)間和延遲時(shí)間會(huì)得出不同滴度曲線(xiàn)（左）和試驗(yàn)窗口值W（右），其優(yōu)化設(shè)置為20us延遲時(shí)間，200us檢測(cè)時(shí)間。

Mu 阿片受體結(jié)合試驗(yàn)：

μ-阿片受體與內(nèi)啡肽有較高親和力（μ=嗎啡），μ受體激動(dòng)劑是鴉片生物堿嗎啡。通過(guò)受體激動(dòng)劑來(lái)激活μ受體，例如嗎啡鎮(zhèn)能夠鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)靜，降血壓，精神歡快和降低呼吸頻率，長(zhǎng)時(shí)間或者高劑量使用阿片能夠?qū)е聶C(jī)體耐受下降，如果阿片攝入過(guò)量會(huì)導(dǎo)致由于機(jī)體呼吸困難造成缺氧而死。如果過(guò)量攝入阿片可以使用阿片拮抗劑（如納洛酮和納曲酮）來(lái)抵消其作用。

這里我們給出了活細(xì)胞受體結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，Mu-阿片受體使用Tb/紅色受體（Tag-lite® Dynamic TR-FRET）方法標(biāo)記，SpectraMax Paradigm多功能讀板機(jī)來(lái)評(píng)價(jià)其與配體結(jié)合和與不同化合物反應(yīng)的抑制常量。

圖七：使用SpectraMax Paradigm多功能讀板機(jī)系統(tǒng)在Mu-阿片配體結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)的結(jié)果（右），試驗(yàn)窗口和Z值分別是5.3X和0.89。

胰高血糖素 GLP-1結(jié)合試驗(yàn)：

GLP1受體被認(rèn)為廣泛表達(dá)于胰島β細(xì)胞中，激活GLP1受體會(huì)刺激腺苷環(huán)化酶途徑，最終導(dǎo)致胰島素含量增加和釋放，因此GLP1受體作為治療糖尿病潛在靶點(diǎn)，GLP1受體也可以表達(dá)于大腦中，參與控制食欲，調(diào)節(jié)記憶力和學(xué)習(xí)力等。通過(guò)SpectraMax Paradigm多功能讀板機(jī)系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)胰高血糖素GLP1受體配體結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)過(guò)程。

圖八：SpectraMax Paradigm多功能讀板機(jī)用于GLP1肽受體激動(dòng)劑的試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)窗口值和Z值分別是19X和0.78。

結(jié)論：

• SpectraMax Paradigm和M5e多功能讀板機(jī)在幾個(gè)Cisbio試驗(yàn)中均有出色的表現(xiàn)：cAMP檢測(cè)，pERK和PAKT激酶試驗(yàn)和Tag-lite配體結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。
• 通過(guò)對(duì)兩款儀器設(shè)置的優(yōu)化，針對(duì)Tag-lite試驗(yàn)（使用384孔板），通過(guò)試驗(yàn)窗口和Z值對(duì)它們的表現(xiàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果非常好。
• 縮短SpectraMax Paradigm多功能讀板機(jī)的延遲時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間，會(huì)得出更好結(jié)果。
• SpectraMax Paradigm多功能讀板機(jī)和Tag-lite技術(shù)結(jié)合，會(huì)成為一個(gè)強(qiáng)大的、具有高通量特點(diǎn)的，可研究細(xì)胞表面結(jié)合和功能性的平臺(tái)。