AlphaLISA篩選技術(shù)在SpectraMax Paradigm多功能檢測(cè)平臺(tái)上的應(yīng)用
Molecular Devices公司的SpectraMax® Paradigm®多功能檢測(cè)平臺(tái)是市場(chǎng)上唯一一個(gè)用戶(hù)可升級(jí)的微孔板檢測(cè)平臺(tái)，使用戶(hù)可以在不到兩分鐘內(nèi)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)功能配置。如果需要使用Alpha技術(shù)，用戶(hù)可以在任何時(shí)候自己升級(jí)。SpectraMax Paradigm平臺(tái)能夠快速對(duì)TNF-alpha因子進(jìn)行定量，通過(guò)對(duì)TNF-alpha刺激的人內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞因子的定量實(shí)現(xiàn)抗炎代謝產(chǎn)物的高靈敏篩選。
AlphaLISA®是一種基于微珠的均相檢測(cè)技術(shù)，用于在微孔板中研究分子之間的相互作用�？梢杂糜诩�(xì)胞因子的定量以及篩選具有抗炎活性的化合物。和傳統(tǒng)的ELISA方法相比，ELISA需要多次洗滌步驟，而洗滌操作可能破壞貼壁的細(xì)胞。AlphaLISA無(wú)需洗滌，減少細(xì)胞損失，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果SD值更小，數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。
TNF-alpha純化和定量
首先，需要獲得純化的TNF-alpha蛋白，用于刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。為此目的，人TNF-alpha因子在Pichia pastoris酵母中進(jìn)行表達(dá)。使用酵母的好處是既可以表達(dá)大量的重組蛋白又不會(huì)產(chǎn)生干擾細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)的內(nèi)毒素。我們可以從每升酵母培養(yǎng)物中純化獲得10-20mg具有生物活性的蛋白。SpectraMax Paradigm平臺(tái)使用AlphaLISA方法可以定量低至pmol級(jí)的蛋白（圖1）。使用軟件內(nèi)置的經(jīng)過(guò)優(yōu)化的檢測(cè)程序，可以在2分鐘內(nèi)完成384孔板的檢測(cè)。
然后，我們開(kāi)發(fā)出一個(gè)AlphaLISA分析方法，用于檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-alpha刺激后產(chǎn)生的促炎癥因子的水平。使用上面純化的人重組TNF-alpha蛋白處理人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HLMVEC）誘導(dǎo)細(xì)胞間粘附因子1（ICAM-1）表達(dá)。在孵育處理18小時(shí)后ICAM-1被上調(diào)表達(dá)。使用AlphaLISA對(duì)ICAM-1的表達(dá)水平進(jìn)行定量（圖2A）。
內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-alpha或LPS刺激后，表達(dá)分泌IL-8。IL-8是一種中性白細(xì)胞的趨化蛋白，而中性白細(xì)胞可以在體內(nèi)浸潤(rùn)發(fā)炎的組織。因此，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的IL-8進(jìn)行定量，可以提供很有價(jià)值的在體外血管內(nèi)皮細(xì)胞促炎癥反應(yīng)狀態(tài)信息。為了評(píng)估分泌的IL-8水平，我們使用AlphaLISA分析了經(jīng)過(guò)處理的HL-MVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品（圖2B）。
ICAM-1和IL-8在HL-MVEC內(nèi)表達(dá)上調(diào)（圖2）
TNF–alpha處理細(xì)胞18小時(shí)后，使用SpectraMax Paradigm平臺(tái)的AlphaLISA方法檢測(cè) HL-MVEC細(xì)胞內(nèi)ICAM-1 (A) 和IL-8 (B) 的上調(diào)水平。
基于內(nèi)皮細(xì)胞篩選鑒定抗炎化合物
藍(lán)藻是一種藍(lán)綠色藻類(lèi)，它具有非常多樣的代謝產(chǎn)物。其中一些代謝產(chǎn)物具有很好的治療前景，目前正在研究用于治療炎癥疾病。1,2,3我們使用上面描述的方法從藍(lán)藻中篩選具有抗炎癥的化合物。HL-MVEC預(yù)先使用從Nostoc藍(lán)藻中提取的不同組分進(jìn)行處理，然后使用0.4ng的人TNF-alpha蛋白進(jìn)行刺激。18個(gè)小時(shí)后，在SpectraMax Paradigm平臺(tái)上使用AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)得到ICAM-1得以上調(diào)表達(dá)，然后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行進(jìn)一步分析IL-8的水平。我們發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻8721,6組分（圖3）可以顯著降低ICAM-1的產(chǎn)生，顯示出抗炎癥活性。這個(gè)組分也明顯降低IL-8的表達(dá)分泌（數(shù)據(jù)未給出）。在進(jìn)行AlphaLISA檢測(cè)前，也對(duì)組分進(jìn)行了細(xì)胞毒性檢測(cè)，顯示其細(xì)胞毒性作用很小，可以忽略。
藍(lán)藻中抗炎活性成分的篩選（圖3）
使用AlphaLISA分析藍(lán)藻中各組分的ICAM-1上調(diào)效應(yīng)。組分8721,6可以顯著降低ICAM-1的表達(dá)生成。
總結(jié)
SpectraMax Paradigm平臺(tái)聯(lián)合AlphaLISA提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，可以使用基于內(nèi)皮細(xì)胞、病理相關(guān)的模型篩選新型的治療藥物。高靈敏度、高速度、高達(dá)1536孔板的兼容性以及內(nèi)置的預(yù)先優(yōu)化的檢測(cè)程序，使用戶(hù)操作更簡(jiǎn)單、運(yùn)行更快速。SpectraMax Paradigm是你使用Alpha技術(shù)篩選藥物的最好選擇。
致謝
最后我們要感謝Maren Plüger Anita Eigner、Maria Hirschler、Linda Kotnik、Katrin Fuchslueger、Julia Schweiger、Christoph Wiesner、Andreas Eger、Wolfgang Schütt以及IMC大學(xué)的Harald Hundsberger、Czech 科學(xué)院的Jiri Kopecky，感謝他們慷慨提供數(shù)據(jù)。
參考資料
1. Rasool, M.; Sabina, E. P.; Lavanya, B. Biol Pharm Bull 2006,29(12), 2483
2. Romay, C.; Armesto, J.; Remirez, D.; Gonzalez, R.; Ledon, N.; Garcia, I. Inflamm Res 1998, 47(1), 36.[31]
3. Prinsep, M. R.; Thomson, R. A.; West, M. L.; Wylie, B. L. J Nat Prod 1996, 59(8),
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