這篇文章主要描述了當使用Molecular Devices公司推出的SpectraMax® Paradigm® 微孔板檢測儀檢測Bellbrook 實驗室的Transcreener熒光偏振系列試劑盒時，如何對儀器參數(shù)進行優(yōu)化，以滿足其驗證要求。

 

•            Transcreener ADP2 FP (3010)

•            Transcreener AMP/GMP (3006)

•            Transcreener UDP FP (3007)

•            Transcreener GDP FP (3009)

 

Transcreener高通量篩選試驗是基于對體系內數(shù)千種不同細胞酶在催化底物時獲得ADP后，檢測其ADP含量的一種通用性，高通量生化檢測平臺。這些酶中的大部分能催化細胞信號通路中的共價反應，是藥物篩選的高價值靶點。Transcreener 熒光偏振試驗采用單步、免疫競爭法，直接檢測標記有遠紅外熒光示蹤分子的核苷酸偏振值，其所有試驗的檢測試劑均由遠紅外熒光示蹤分子與高特異性的單克隆或多克隆抗體結合而成，原理是在靶標酶催化底物后，所產生的核苷二磷酸或者單核苷酸競爭性的取代了抗體連接的遠紅外熒光示蹤分子，其遠紅外熒光示蹤分子的旋轉自由度增高，導致熒光偏振現(xiàn)象的減弱（如圖1），使用遠紅外熒光示蹤分子可以有效降低熒光化合物和光散射的干擾，Transcreener 熒光偏振試驗均采用一步添加，混勻既讀的方式，特別適合高通量篩選。

 

SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測儀采用靈活的卡盒式設計，可以針對不同試驗實驗類型選擇最適合的檢測卡盒以獲得最佳檢測結果，儀器所具有雙光電倍增二極管（PMT）能夠同時工作，用以檢測熒光偏振信號值，做到在不降低檢測靈敏度的同時提高其檢測速度。儀器不但可以支持1536孔板且能夠與MD公司推出的StakMax®堆板機進行整合，大大增加了檢測的速度和通量。針對Transcreener熒光偏振試驗的特點對儀器進行優(yōu)化設置后，SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測儀的表現(xiàn)完全超過了試驗本身對儀器性能的要求。

 

為了發(fā)揮Transcreener高通量篩選檢測試驗的優(yōu)勢，其中關鍵性因素是如何對微孔板檢測儀進行參數(shù)上的設置和優(yōu)化，無論是針對那種類型的檢測試驗，正確的參數(shù)設置和優(yōu)化都會增加其檢測的靈敏度。為了找到適合Transcreener高通量篩選試驗的最佳參數(shù)設置，我們做出24條重復的模擬10uM ATP/ADP酶的反應過程的標準曲線。起始濃度為10uM ATP，其中ADP含量的增加與ATP含量的減少是成一定的比例關系，維持總腺嘌呤核苷酸濃度在10uM左右。通過改變不同的檢測時間(Integration time)來滿足其試驗Z值>0.5的要求，驗證一臺儀器是否能夠滿足Transcreener熒光偏振試驗的要求，在10uM ATP的轉化率為10%的情況其Z值>0.7且ΔmP > 120。

 

•            ATP/ADP混合物-4 mM MgCl₂、2 mM EGTA、50 mM HEPES、pH 7.5、1% DMSO

0.01% Brij-35和ATP/ADP（腺嘌呤濃度為10uM）

•            ADP檢測混合物-1x終止&檢測緩沖液B、4 nM ADP Alexa633示蹤分子和14.8 ug/ml ADP²抗體

•            單示蹤分子-1x終止液&檢測緩沖液B和4 nM ADP Alexa633示蹤分子

•            空白緩沖液-1x終止液&檢測緩沖液B和14.8 ug/ml ADP²抗體

 

詳細的檢測步驟，包括準備制作標曲、請參照Transcreener技術手冊()

 

步驟一：將10ul的ATP/ADP化合物分別加入384孔板的每行中

步驟二：在這些行中加入10ul ADP混勻

步驟三：加入10ul的10 μM ATP/0 μM ADP化合物于384孔板的行P中

步驟四：在P1-P12行中的每孔中加入10ul的單示蹤分子

步驟五：在P13-P24行中的每孔中加入10ul的空白緩沖液

 

SpectraMax Paradigm微孔板檢測儀由SoftMax® Pro 軟件控制，可以在其軟件模板庫中選擇此試驗類型的模版文件并更改其具體的參數(shù)設置。

 

步驟一：打開SoftMax Pro操作軟件，點擊‘Protocol Manager’選項，在其‘Protocol Library’即模版庫中選擇預先設置好的模版，在‘Paradigm Protocol’文件夾下選擇‘FP Rhodamine’模版

步驟二：點擊軟件左側導航樹的‘Plate01’后，再點擊右側的‘Settings’即設置按鍵（齒輪狀圖標），出現(xiàn)設置對話框

步驟三：選擇Alexa Fluor633 熒光偏振卡盒

步驟四：檢測模式選擇‘FP’即熒光偏振模式，檢測類型選擇‘Endpoint’即終點法

步驟五：卡盒已固定其檢測波長，無需再設置

步驟六：點擊‘Plate Type’后選擇‘384 wells’微孔板類型，然后選擇‘384 Well

Corning low vol/rndbtm’

步驟七：點擊‘Read Area’選擇微孔板檢測區(qū)域（孔）

步驟八：點擊‘PMT and Optics’選擇‘Off – Stop and Go’或‘Performance – On the fly’讀取速度模式

步驟九：如果選擇Stop and Go模式時，在‘integration time’ 處輸入20ms或者更高數(shù)值，延長時間可以獲得更好的結果，但是會延長檢測時間

步驟十：如果已知最佳檢測高度，直接輸入即可，當采用新試驗或者新微孔板時，應該重新進行高度優(yōu)化設置，高度優(yōu)化前的原始值為1mm，進行優(yōu)化后，新的高度值會取代原始值

步驟十一：點擊‘More Settings’，選擇以行或者列的方式來確定檢測順序

步驟十二：選擇‘Show Pre-Read Optimization Options’

步驟十三：點擊‘OK’鍵后關閉設置對話框

步驟十四：點擊‘Read’按鍵，屏幕中央會出現(xiàn)一個優(yōu)化選擇對話框，針對新試驗需重新進行微孔板優(yōu)化和檢測高度的優(yōu)化

 

反應過程中，伴隨著ADP含量的增加，其與ATP比例發(fā)生變化，與抗ADP抗體結合的示蹤分子減少，導致了反應體系中熒光偏振信號值降低，SpectraMax Paradigm針對此試驗中所給出的15個數(shù)據(jù)點進行檢測后，得出數(shù)值后自動擬合生成標準曲線。

 

 

A：模擬10uM ATP轉化至ADP時標準曲線的Z值和Δ mP值；B：當微孔板檢測儀設置為100ms檢測時間，放大標準曲線視圖，ADP濃度范圍在0-3uM之間時顯示出驗證Z值的最少數(shù)據(jù)點（紅色虛線）和驗證Δ mP值的最少數(shù)據(jù)點(水平黑色虛線)，也顯示出10%ATP轉化驗證點（垂直黑色虛線）

 

此篇應用文驗證了Molecular Devices推出的SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測儀能夠滿足Transcreener熒光偏振檢測試驗對儀器性能的要求，我們對儀器參數(shù)進行設置和優(yōu)化后，可以在1分鐘以內獲得相應值（Z值>0.7和Δ mP > 120），當延長檢測時間時，其結果遠超過最低驗證最低要求，當使用‘on-the-fly’飛行檢測模式時，仍能滿足試驗需求且檢測時間小于1分鐘。

 

Molecular Devices公司對Bellbrook實驗室的Meera Kumar女士的大力協(xié)作表示衷心的感謝