【摘要】 目的 研究神經(jīng)干細胞 (NSCs)移植對改善新生大鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)后感覺運動障礙的作用。

方法  7d齡新生SD大鼠,隨機分為假手術(shù)組, HIBD組和腦內(nèi)移植組 ,后兩組 H I BD損傷后3 d分別在左側(cè)感覺運動皮質(zhì)區(qū)植入BrdU標(biāo)記的 NSCs或培養(yǎng)基作為對照 ,觀察植入 4周后大鼠感覺運動功能的變化和移植細胞在腦內(nèi)的存活和分化情況。結(jié)果 與 H I BD組比較 ,移植組在 T迷宮和四項感覺運動功能測試中,表現(xiàn)出明顯的改善。在T迷宮中,自發(fā)改變率(69.23±13.34) % vs (45.00±27.27)%] (P<0.05)上升;在握持牽引試驗中 ,握持時間明顯延長 [ (49.15±13.39) s vs (27.20±15.18) s ] ( P <0.05) ;在肢體放置和足錯誤試驗中的不對稱性消失 ,姿勢反射也明顯改善 ( P < 0 . 05 )。BrdU間接免疫熒光顯示移植后 4周 ,在腦內(nèi)可見存活的 NSCs分布于移植點附近; BrdU和 NF2 200免疫熒光雙標(biāo)顯示移植后4周 NSCs可部分分化為神經(jīng)元表達 NF2 200。 結(jié)論 腦內(nèi)移植 NSCs對 H I BD新生大鼠的感覺運動機能和行為的恢復(fù)有良好的促進作用。

【關(guān)鍵詞 】 神經(jīng)干細胞; 移植; 感覺運動; 缺氧缺血; 大鼠

新生兒缺氧缺血性腦病 (H IE)的病死率高 ,預(yù)后差,可產(chǎn)生永久性神經(jīng)功能障礙。目前對新生兒 H IE的治療僅局限于支持療法 ,尚無促進神經(jīng)再生的手段[ 1 ]。目前 ,在使用神經(jīng)干細胞 (NSCs)移植治療缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)的動物實驗和臨床實驗中,均已取得了一定的療效[2]。但是這些研究結(jié)果大多來自于成年動物和成年人,NSCs移植能否改善新生大鼠HIBD后的感覺運動障礙尚未見報道。本研究探討腦內(nèi)移植胚鼠 NSCs對新生大鼠 H I BD后感覺運動功能的影響。

SD大鼠 (清潔級)。DMEM /F12 ( 1: 1 )、 B27 ( Gibco ) , bFGF、EGF ( Pep r oTech EC)�？� NF2 200、 抗 B rdU (NeoMarkers)。大鼠腦立體定位儀, T迷宮、 常壓缺氧艙均為參照文獻自制。

取孕 14 d S D大鼠的胚胎 ,分離前腦皮質(zhì)組織 ,胰酶消化吹打制成單細胞懸液后接種于含 10 ng/mlbFGF和 20 ng/ml EGF的 DMEM /F12培養(yǎng)基 (另含 B2720μl /ml)中培養(yǎng) ,每 2～3 d半量換液 1次。移植前3 d,將準備移植的 NSCS換液 ,同時在培養(yǎng)基內(nèi)加入 B r2dU孵育 ,終濃度為 10μmol /L。收集在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng) 1月并經(jīng) BrdU標(biāo)記的 NSCs備移植用。4%臺盼藍染色細胞計數(shù) ,活細胞 > 95% ,調(diào)整活細胞密度為 5×104個細胞 /μl,置冰上備用。

新生7d齡SD大鼠,共35只,隨機分為假手術(shù)組( Sham, n = 10),HIBD+培基移植對照組 (HIBD, n=12) , H I BD+NSCs移植組 (NSCs,n = 13)。

參照Rice方法[3],7d齡SD新生鼠乙迷麻醉后分離出左頸總動脈并結(jié)扎,休息2 h后,將大鼠置于有機玻璃低氧艙內(nèi),氧濃度在8%(7%～9%) ,艙內(nèi)溫度控制在(36±2)℃,濕度為70% ±5% ,缺氧時間持續(xù)

2 h。實驗結(jié)束后將大鼠放回鼠籠由母鼠行母乳喂養(yǎng)。

HIBD損傷后3d,低溫麻醉后,將動物固定于立體定位儀 ,以左側(cè)感覺運動皮層區(qū)(坐標(biāo)AP:+ 0. 3mm,ML:-2mm, DV:-1.5mm)為移植點 ,使用微量進樣器緩慢注入 2μl NSCs細胞懸液或培養(yǎng)基。

42 d齡時測試。參照 Bona[ 4 ]方法,包括4個試驗。行為學(xué)測試均按盲法進行。

1 .握持牽引試驗:大鼠用前爪抓住離桌面45cm水平放置的直徑為0.6 cm的空心塑料管懸掛,記錄其懸掛的時間(最大值為60 s,超過60s按60s計)和右側(cè)(缺血對側(cè))后肢能否放到管子上。

2 .足錯誤試驗:記錄大鼠在水平放置的網(wǎng)格上(50cm×40 cm,每格3cm×3cm) 2min內(nèi)前、后肢或爪子掉下來的次數(shù) ,為排除不同大鼠活動度的差別的影響,只將左右側(cè)錯誤次數(shù)的差值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 .姿勢反射試驗:抓住大鼠的尾巴 ,使之懸掛于距離桌面 50 cm高處。正常鼠將兩個前肢都伸向桌面(0分,而有腦損傷的大鼠損傷大腦半球?qū)��?cè)的肢體呈屈曲狀(1分) ,然后將大鼠放在桌上,在肩后的側(cè)面加壓直到前肢伸直 ,重復(fù)數(shù)次 ,如果朝右側(cè) (損傷大腦半球的對側(cè) )的抵抗力減弱為異常 (2分)。

4 .肢體放置試驗:記錄大鼠在 6種不同的感覺刺激下左右側(cè)前后爪的放置情況 ,記錄每只鼠兩側(cè)得分的差值。計分標(biāo)準如下: 0分 ,爪子放置正確、 迅速; 1分 ,遲緩或不完全正確; 2分 ,未放置。

參照 Balduini[ 5 ]方法。

1 . T迷宮自發(fā)交替:自 28 d齡起檢測。檢測動物在 T迷宮內(nèi)連續(xù)測試中進入不同臂的趨勢。每只動物連續(xù)測試 3 d,每日 1次 ,每次給兩次改變方向的機會,結(jié)果分別記錄為改變率 0% , 50% ,或 100% ,同時記錄進入左右臂的次數(shù)。

2 . T迷宮強迫改變:自32d齡起檢測。測試分為兩個階段,預(yù)測試和測試。預(yù)測試時,動物被迫只能進入開放的臂內(nèi),并將食物吃完 ,然后將之放入起始臂內(nèi),關(guān)15 s后撤去所有的閘門開始測試。如果動物進入預(yù)測試時未進入的臂內(nèi) ,記錄為正確;如果進入預(yù)測試時已進入的臂內(nèi) ,記錄為錯誤。每只動物每日測試5次 ,每次間隔 15min,連續(xù) 4 d,共 20次。

根據(jù)使用說明書進行 nestine、 BrdU和 NF2 200單染或雙染操作。

計量數(shù)據(jù)以x±s表示,數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。

原代培養(yǎng)細胞24 h內(nèi)就可以形成由2～3個細胞組成的小細胞團,即原代克隆,7d時生長為數(shù)十個細胞到數(shù)百個細胞的克隆 ,懸浮生長 ,呈球形。傳代后出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的大量次代克隆,5～7d可再次傳代。間接免疫熒光細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),NSCs標(biāo)記蛋白nestin在各級克隆中都有表達。

1 . T迷宮自發(fā)交替試驗:HIBD組的大鼠選擇左側(cè)(缺血側(cè)) >右側(cè),差異有顯著性意義(P< 0.05)。21T迷宮強迫改變:隨天數(shù)的增加,Sham組與NSCs組的正確率日漸增加,而HIBD組的正確率上升不明顯 ,說明學(xué)習(xí)能力較差。NSCs組的正確率較HIBD組有明顯增高 ,差異有顯著性意義 ( P < 0 . 05)。3 .感覺運動功能測試: NSCs組的握持牽引時間較HIBD組延長( P<0.05)。足錯誤試驗中, NSCs組的足錯誤次數(shù)右2左差值較HIBD組減少(P<0.05)。在姿勢反射測試中,NSCs組的正常率較HIBD組明顯增加(P< 0.05)。在肢體放置試驗中,NSCs組右-左的得分較HIBD組明顯減少(P<0.05)。41NSCs移植后檢測: NSCs移植 1月后 ,均可見不同程度的 BrdU陽性細胞沿針道分布 ,大量分布于移植點周圍 ,向腦實質(zhì)內(nèi)擴散 ,隨與移植點距離的增大陽性細胞逐漸減少。B rdU和NF2 200的免疫熒光雙標(biāo)顯示部分BrdU陽性細胞同時也表達神經(jīng)元特異性抗原NF2 200,提示NSCs移植到大鼠腦內(nèi)1月后可分化為神經(jīng)元。

研究表明 ,移植 NSCs入發(fā)育的大鼠腦內(nèi) ,細胞廣泛遷移,其分化結(jié)果與移植的部位有關(guān)。說明在體外擴增后,由NSCs分化的神經(jīng)元保持了對新生鼠腦結(jié)構(gòu)識別與定位的反應(yīng)能力[ 6 ]。但是移植NSCs到成年動物的腦內(nèi),僅在神經(jīng)發(fā)生的部位,如海馬才能分化為神經(jīng)元,而在非神經(jīng)發(fā)生的部位如小腦、紋狀體和脊髓則主要分化為膠質(zhì)細胞[7 ]。干細胞移植后的遷移能力和與宿主神經(jīng)細胞整合能力也隨年齡增長而逐漸下降[ 8 ],而且新生大鼠免疫機能不完善 ,腦內(nèi)移植后宿主的排異反應(yīng)相對較小。由此可見成年期和新生期的宿主對移植的 NSCs的反應(yīng)是不同的,干細胞移植治療新生兒腦損傷性疾病較成人更有前途。本實驗結(jié)果顯示,從大鼠14d胚胎前腦皮質(zhì)組織中分離出來的NSCS在生長因子EGF和bFGF存在的條件下可長期維持未分化狀態(tài)并不斷增殖 ,在撤除生長因子后,可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,具備了NSCS的基本屬性。將NSCs移植到新生大鼠HIBD模型的感覺運動皮質(zhì)區(qū),可有效的改善HIBD所致的感覺運動障礙,在握持牽引測試、姿勢反射、足錯誤試驗和肢體放置試驗中的成績較對照組明顯提高;同時還有效的改善空間認識和學(xué)習(xí)記憶缺陷 ,在 T迷宮強迫改變試驗中的正確率增加。移植后 4周 ,所有的移植治療大鼠在移植部位都可見到存活的細胞 ,沿移植點向遠處遷移。本研究將 NSCs移植到感覺運動皮質(zhì)后,能有效地改善其感覺運動缺陷,其機制可能與神經(jīng)重建有關(guān),免疫熒光雙標(biāo)也顯示部分 BrdU陽性細胞同時也表達神經(jīng)元特異性抗原NF2200,提示NSCs移植后可分化為神經(jīng)元 ,可能是其發(fā)揮治療作用的機理之一。結(jié)果提示, NSCs移植到新生大鼠 H I BD后的腦內(nèi) ,不僅能存活 ,還能很好的與宿主腦組織整合并遷移,并可改善其遠期的學(xué)習(xí)記憶、空間辨別能力和感覺運動功能。為 NSCs移植治療新生兒 H IE提供了實驗依據(jù)。