通過斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證DIG標(biāo)記探針的靈敏度（圖2）。將標(biāo)記好的探針進(jìn)行一系列的濃度梯度稀釋，點(diǎn)樣于陽(yáng)離子尼龍膜上。同時(shí)，DIG Northern Starter Kit中提供有已知濃度的DIG標(biāo)記的β-actin RNA作為陽(yáng)性對(duì)照。將樣品點(diǎn)樣并交聯(lián)在膜上后，直接進(jìn)行抗體結(jié)合和底物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（偶聯(lián)AP的地高辛抗體和CDP-Star化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系，均在試劑盒中提供）。DIG標(biāo)記的探針如在0.1pg的稀釋點(diǎn)處顯色，表明標(biāo)記探針的靈敏度十分理想。進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)的探針靈敏度應(yīng)至少達(dá)到1pg稀釋點(diǎn)的檢出，否則探針的靈敏度不足以獲得穩(wěn)定的雜交研究結(jié)果。

圖2： DIG探針標(biāo)記反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。顯色條件為羅氏化學(xué)發(fā)光試劑CDP-Star，曝光5min。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有探針（除p53探針）均在0.1pg濃度處檢出。（數(shù)據(jù)來源于）

 

 

增加啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度將對(duì)探針標(biāo)記效率產(chǎn)生影響，獲得更高產(chǎn)量的探針（圖3）。如可將T3啟動(dòng)子的序列增長(zhǎng)為5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; T7啟動(dòng)子的序列增長(zhǎng)為5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'。

圖3：T3/T7啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度對(duì)探針標(biāo)記效率的影響。在基礎(chǔ)啟動(dòng)子序列（啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄翻譯所需的最短序列）上附加4個(gè)堿基，可顯著增加探針的轉(zhuǎn)錄合成產(chǎn)量。（數(shù)據(jù)來源于）

 

羅氏地高辛產(chǎn)品系列廣泛應(yīng)用于核酸標(biāo)記和雜交檢測(cè)，具有高度靈敏、標(biāo)記檢測(cè)方便和探針可重復(fù)使用等特點(diǎn)。地高辛標(biāo)記的探針可在-15 ~ -25°C穩(wěn)定保存至少一年的時(shí)間。

 

DIG Northern Starter Kit是為DIG 系統(tǒng)初次使用者設(shè)計(jì)的試劑盒，試劑盒中包含了獲得成功、可重復(fù)的雜交檢測(cè)結(jié)果的所有必須試劑。該試劑盒以線性化DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄過程合成大量RNA轉(zhuǎn)錄本，RNA分子合成過程中摻入DIG-11-UTP底物，從而獲得DIG標(biāo)記的RNA探針。DIG Northern Starter Kit中的是專為地高辛雜交系統(tǒng)優(yōu)化的雜交緩沖液。在進(jìn)行雜交體檢測(cè)時(shí)，應(yīng)用試劑盒提供的偶聯(lián)有堿性磷酸酶（AP）的DIG抗體和CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物，在短時(shí)間內(nèi)獲得高度靈敏、特異的雜交檢測(cè)結(jié)果。

配合使用，能夠避免配制雜交過程中用到的洗滌和封閉緩沖液的麻煩，并有助于提高雜交檢測(cè)的質(zhì)量和重復(fù)性。

 

當(dāng)您對(duì)地高辛系統(tǒng)熟悉后，可根據(jù)您的研究需求靈活選擇地高辛RNA標(biāo)記反應(yīng)液（DIG RNA Labeling Mix）和試劑盒（DIG RNA Labeling Kit），及其他檢測(cè)系統(tǒng)（DIG Luminescent Detection Kit和DIG Nucleic Acid Detection Kit）。