微型模式動(dòng)物、模式植物種子、大體積細(xì)胞及微球的分選在生命科學(xué)研究中有著非常廣泛的應(yīng)用，但是由于這些對(duì)象體積太大，普通流式細(xì)胞儀難以對(duì)其進(jìn)行分選，而手工鏡下分選耗時(shí)耗力、效率低下、準(zhǔn)確性難以保證，因此一種自動(dòng)化大體積微粒分選系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，它就是本文介紹的COPAS^TM多參數(shù)生物微粒分析與分選系統(tǒng)。

 

COPAS^TM生物分選系統(tǒng)，這一目前市面上唯一的能夠分選40-1500um生物微粒的全自動(dòng)、高通量分選系統(tǒng)，是由位于美國(guó)馬薩諸塞州的Union Biometrica公司出品。該公司作為Harvard  Bioscience的子公司，專門致力于生物分選系統(tǒng)的研究、設(shè)計(jì)和制造。COPAS^TM系統(tǒng)可以檢測(cè)微粒的尺寸、光密度及熒光信號(hào)，并根據(jù)用戶設(shè)定的域值，將相應(yīng)的微粒噴人96孔板或其它容器中，整個(gè)過(guò)程對(duì)于微粒的生物活性不會(huì)產(chǎn)生任何負(fù)面影響。

 

一、工作原理 

圖2. On-bead assays技術(shù)原理(A)與COPAS微球分選示意圖(B)

 

COPAS^TM生物分選系統(tǒng)可以運(yùn)用到On-bead assays技術(shù)的多個(gè)領(lǐng)域(圖3)，比如微球的質(zhì)控，COPAS^TM可以分選出破損、塌陷和粘合的微球，從而保證用于實(shí)驗(yàn)的微球的完整性;根據(jù)微球表面的熒光標(biāo)記進(jìn)行分選;從已經(jīng)結(jié)合了化合物的微球中，去除那些結(jié)合了自發(fā)熒光化合物的微球，以避免假陽(yáng)性。其中根據(jù)微球表面熒光信號(hào)進(jìn)行分選是用途最廣的應(yīng)用，現(xiàn)舉幾個(gè)例子進(jìn)行說(shuō)明。

圖3.  COPAS^TM分選技術(shù)在On-bead assays中的應(yīng)用(A)，分選熒光微球時(shí)的散點(diǎn)圖(B)

 

 

使用COPAS生物分選系統(tǒng)在以微球?yàn)檩d體的化合物庫(kù)中篩選能與帶有熒光標(biāo)記的目標(biāo)蛋白結(jié)合的化合物，將陽(yáng)性化合物微球加人微孔板以進(jìn)行后續(xù)的MS,NMR及其它分析，將沒(méi)有結(jié)合蛋白的陰性化合物微球加人收集容器以便重復(fù)使用。另外，還可以根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱設(shè)定域值，將陽(yáng)性化合物微球進(jìn)一步分為結(jié)合能力不同的幾群。目前，已經(jīng)有科學(xué)家利用這種技術(shù)找到了一個(gè)能與纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子粘多糖結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的硫酸鹽化合物。

 

 

 

將需要研究的多膚，如點(diǎn)突變多膚，兩端標(biāo)記上淬滅熒光基團(tuán)(FRAP )，然后連接到微球上，從而建立一個(gè)以微球?yàn)檩d體的多膚庫(kù)。將多膚微球與目的蛋白酶結(jié)合，如果蛋白酶能夠切斷多膚，就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。由于使用COPAS高速分選技術(shù)，陽(yáng)性微球可以被快速分選，以保證微球表面仍有足夠多的完整多膚以便進(jìn)行后續(xù)分析。從建立多膚庫(kù)到陽(yáng)性多膚序列分析的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，可以在一周內(nèi)完成，與傳統(tǒng)方法相比效率提高了一百倍。丹麥的一個(gè)研究小組已經(jīng)利用該技術(shù)研究了枯草桿菌蛋白酶的多膚底物結(jié)構(gòu)。

 

 

 

COPAS技術(shù)的一個(gè)更為復(fù)雜的應(yīng)用是在蛋白酶抑制劑篩選方面。首先，將帶有淬滅熒光基團(tuán)(FRAP )的蛋白酶底物多膚連接在微球的一部分結(jié)合位點(diǎn)上，然后將需要篩選的抑制劑連接在微球的其它結(jié)合位點(diǎn)上，從而建立一個(gè)以微球?yàn)檩d體的抑制劑庫(kù)。將微球與蛋白酶一起孵育，如果抑制劑無(wú)效，蛋白酶會(huì)將多膚切斷，微球產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)。如果抑制劑效果很強(qiáng)，蛋白酶無(wú)法切斷多膚，微球沒(méi)有熒光信號(hào)。如果抑制劑無(wú)法完全抑制蛋白酶活性，那么仍會(huì)有部分多膚被切斷，微球會(huì)發(fā)出較弱的熒光信號(hào)。這樣就可以利用COPAS技術(shù)根據(jù)微球熒光信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)微球進(jìn)行分選，從而快速找到不同抑制強(qiáng)度的抑制劑。這種技術(shù)在篩選抑制劑和優(yōu)化反應(yīng)條件方面具有很高的效率和很大的靈活性，可以實(shí)現(xiàn)每小時(shí)100000個(gè)化合物的高速篩選。利用這種技術(shù)，荷蘭的一個(gè)研究小組在數(shù)周內(nèi)找到了胰蛋白酶和多種基質(zhì)金屬蛋白酶的多種抑制劑。

 

 

綜上所述，由于 COPAS^TM生物分選系統(tǒng)在微粒分選方面的強(qiáng)大功能，其與On-bead  assays技術(shù)的結(jié)合必將成為藥物篩選的犀利武器，從而大大提高藥物篩選的效率，為人類健康作出貢獻(xiàn)。

 

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