日本IBL原裝進口，貨號：27131

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G-CSF屬于細胞因子類，刺激中性粒前體細胞的分化和增殖，它由成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，且有報道稱，在某些腫瘤內(nèi)可刺激其增殖。人G-CSF試劑盒可檢測人G-CSF

原理

此試劑盒根據(jù)酶免法的夾心原理，利用兩種不同的高特異性抗體，TMB作為著色劑，顏色強度與人G-CSF的量成正比

7.81~500pg/ml（37℃下第一次孵育1小時）

1.95~250pg/ml（4℃下第一次孵育過夜）：內(nèi)部數(shù)據(jù)

1.       此試劑盒用于細胞上清液中人G-CSF的定量檢測

2.       重組的和天然的G-CSF都可以用此試劑盒檢測

3.       經(jīng)驗表明，由于全血的干擾，血清或EDTA血漿的稀釋比例較低可導致結果更低（見附錄一）

1.       包被板，96孔，包被有抗人G-CSF鼠IgG單抗，親和純化

2.       標記抗體濃縮，30X，0.4mlx1，HRP標記的抗人G-CSF兔IgG Fab’，親和純化

3.       標準品，1.0mlx2，重組人G-CSF

4.       EIA緩沖液，30mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS

5.       標記抗體稀釋液，12mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS

6.       著色劑，15mlx1，TMB底物液

7.       終止液，12mlx1，1N硫酸

8.       洗滌緩沖濃縮液，50mlx1, 40X，含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液

1.       酶標儀（450nm）

2.       移液器和槍頭

3.       燒杯

4.       蒸餾水

5.       孵箱（37±1℃）

6.       坐標紙（對數(shù)-對數(shù)）

7.       吸水紙

8.       標準品稀釋管

9.       洗瓶

10.   一次性試驗管

1.       洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)用完

2.       標記抗體的制備：用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍，即得。

例：如果只測一條板，8孔，則需要標記抗體800ul（30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）

此步驟在實驗前完成

剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內(nèi)，保存在4℃

3.       標準品的制備：吸取1.0ml的去離子水至標準品瓶內(nèi)，充分混勻，得到1000pg/ml的人G-CSF標準品

4.       標準品的稀釋：準備8個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號管                 500pg/ml

2號管                 250pg/ml

3號管                 125pg/ml

4號管                 62.5pg/ml

5號管                 31.25pg/ml

6號管                 15.63pg/ml

7號管                 7.81pg/ml

8號管                 0pg/ml（試驗樣品空白）

吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標準品范圍為500~7.81ng/ml

內(nèi)部實驗步驟（4℃下孵育過夜）

高靈敏度所必須的操作步驟

1）  標準品的準備：吸取2.0ml的去離子水至標準品瓶內(nèi)，充分混勻，得到500pg/ml的人G-CSF標準品

2）  標準品的稀釋：準備9個試管用于標準品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號管                 250 pg/ml

2號管                 125pg/ml

3號管                 62.5pg/ml

4號管                 31.25pg/ml

5號管                 15.63pg/ml

6號管                 7.81pg/ml

7號管                 3.91pg/ml

8號管                 1.95pg/ml

8號管                 0pg/ml（試驗樣品空白）

吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標準品范圍為250~1.95pg/ml,9號管為試驗樣品空白

5.       樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有建立，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測，來確定樣品最佳稀釋比例

實驗步驟

使用前，所有樣品應平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質量無變化，標準曲線和樣品檢測同時進行

如圖：

1.       Reagent Blank孔內(nèi)加入100ul的EIA緩沖液

2.       將試驗樣品空白對照，樣品和稀釋的標準品加100ul至相應的孔內(nèi)；（內(nèi)部操作程序一樣）

3.       蓋板，37℃下孵育1小時（4℃下孵育過夜）

4.       洗板，重復7次以上，吸水紙上拍干；洗板機則洗板4次

5.       每孔加入100ul的標記抗體液，除Reagent Blank孔外

6.       蓋板，37℃下孵育30min

7.       洗板9次，同步驟四

8.       吸取試驗所需的TMB底物液于一次性試管內(nèi)，每孔加入100ul的TMB底物液。剩余的TMB底物液不能再放回至原裝瓶內(nèi)，避免污染

9.       黑暗處，室溫下孵育30min，溶液變藍

10.   每孔加入100ul的終止液，溶液變藍

11.   擦去微孔板底部的污點或水滴，終止液加入后30min內(nèi)，在酶標儀450nm處讀數(shù)

1.       試驗樣品采集后應立即檢測，凍存的樣品避免反復凍融，檢測前應先將其完全溶解混勻

2.       試驗樣品用EIA緩沖液稀釋

3.       試驗樣品和標準品應做雙份檢測

4.       試驗樣品應在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測

5.       只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導致試驗失敗

6.       吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭

7.       TMB底物液應貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬

8.       加入終止液后30min內(nèi)必須酶標儀讀數(shù)

繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應減去試驗樣品空白值，包括標準品和未知的樣品。以標準品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線，從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度

 

附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數(shù)，如坐標參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結果

附錄一：

 

 

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