454高通量測序——研究土壤微生物的新手段
在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，在土壤中生活有數(shù)量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌及超顯微結(jié)構(gòu)微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍(lán)藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，擔(dān)負(fù)著地球C、N、P、S 等物質(zhì)循環(huán)的“調(diào)節(jié)器”[1]、土壤養(yǎng)分植物有效性的“轉(zhuǎn)化器”和污染環(huán)境的“凈化器”等多方面生態(tài)功能[2]。土壤微生物是氣候和土壤環(huán)境條件變化的敏感指標(biāo)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態(tài)特征多樣性和功能多樣性[3]。由于土壤微生物的復(fù)雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。隨著多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序等現(xiàn)代生物學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術(shù)的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數(shù)據(jù)，為直接探究土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進(jìn)行研究的方法
1、微生物平板培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現(xiàn)型來分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。
這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養(yǎng)的微生物類群，無法對絕大多數(shù)微生物的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的深入研究。
2、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合測序的方法
在過去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其16SrDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定未知菌的研究中。20世紀(jì)80年代以來, 逐步建立起了以分子系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩(wěn)定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。
其中運用比較廣泛并被普遍認(rèn)可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴(kuò)增所需G/C 堿基對含量至少達(dá)40 % ，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個群落細(xì)菌數(shù)量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現(xiàn)序列不同的DNA 遷移在同一位置的現(xiàn)象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600堿基的序列，足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進(jìn)行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和準(zhǔn)確性高的特點大量用于微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應(yīng)的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優(yōu)越性體現(xiàn)在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區(qū)域； 測序通量高，可以檢測到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強；無需進(jìn)行復(fù)雜的文庫構(gòu)建，微生物DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測序，實驗周期短；測序數(shù)據(jù)便于進(jìn)行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認(rèn)可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。高通量測序因其數(shù)據(jù)量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應(yīng)出土壤樣本的真實情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應(yīng)用
1.1 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細(xì)菌、真菌和放線菌這三大類群的數(shù)量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數(shù)量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進(jìn)行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454測序法對西半球的一個大的橫斷面的4類土壤進(jìn)行檢測和統(tǒng)計學(xué)評價。結(jié)果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農(nóng)業(yè)土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結(jié)果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點所有序列的0.009%，而農(nóng)業(yè)土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細(xì)菌的多樣性差距非常大，因土壤結(jié)構(gòu)的不同土壤中的細(xì)菌群體也呈現(xiàn)出多樣化。Triplett等[10]基于焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區(qū)域進(jìn)行測序，估測9個草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數(shù)據(jù)序列進(jìn)行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發(fā)現(xiàn)在不同的土壤層中，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質(zhì)有關(guān)的，包括有機碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
1.2 研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養(yǎng)元素在土壤中轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能等，通過分析測定土壤中的一些轉(zhuǎn)化過程, 如有機碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應(yīng)是硝化作用的第一步，也是全球氮循環(huán)中由微生物活動形成硝化鹽的重要進(jìn)程。Leininger[11]檢測了3個氣候區(qū)域12塊原始和農(nóng)業(yè)用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個亞基的基因豐度。采用反向轉(zhuǎn)錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術(shù)對互補DNA測序，證實古細(xì)菌的氨氧化活性要遠(yuǎn)高于細(xì)菌，證實Crenarchaeota可能是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法同時獲得土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和功能信息。結(jié)果認(rèn)為，通過該方法可以同時研究微生物生種群結(jié)構(gòu)與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學(xué)分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達(dá)特征之間的關(guān)系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時也需要運用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結(jié)構(gòu)對應(yīng)起來。對rRNA表達(dá)基因和與環(huán)境因素相關(guān)的主要酶類的基因進(jìn)行定量化和比較分析，將能了解微生物結(jié)構(gòu)與特定功能之間的關(guān)系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環(huán)過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結(jié)合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離并鑒定了9個參與反硝化作用的酶簇[13]。
1.3 研究環(huán)境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環(huán)境的突然改變會導(dǎo)致微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。Zachary等[14]以重水穩(wěn)定同位素探測技術(shù)（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關(guān)的細(xì)菌。通過液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結(jié)合到了所有的DNA結(jié)構(gòu)成分中。盡管這種結(jié)合不是均勻的，還是可以明顯的將標(biāo)記了18O和未標(biāo)記的DNA區(qū)分開來。作者發(fā)現(xiàn)DNA和細(xì)胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發(fā)生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩(wěn)定的，并且摻入到細(xì)菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕后，對土壤中16S rRNA進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態(tài)變化，對微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)行研究和生態(tài)類群的劃分。
注：已用454焦磷酸測序法發(fā)表的文章總結(jié)
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13、Validation of heavy-water stable isotope probing for the characterization of rapidly responding soil bacteria.
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14、Identification of Nitrogen-Incorporating Bacteria in Petroleum-Contaminated Arctic Soils Using 15N DNA-SIP and Pyrosequencing.
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