在單克隆抗體純化中，為了獲得所需高質(zhì)量的抗體，一般使用兩步或三步層析步驟。通常，用于三步工藝的層析介質(zhì)為Protein A→陽離子交換→陰離子交換；用于兩步工藝的層析介質(zhì)為Protein A→Capto adhere（多模式離子交換）。所有的單克隆抗體（Mabs）都有一些相似的特性，所以可以使用同一個平臺方法純化。請注意，平臺并不意味著相同的工藝，它只是表示工藝的某些方面不需要從頭開始開發(fā)，因為可以利用以前單克隆抗體工藝開發(fā)經(jīng)驗。

 

本次討論的目的是提出一種純化工藝，它可以用于哺乳動物細胞生產(chǎn)的大多數(shù)Mabs的純化工藝。這里我們介紹一種基于MabSelectTMSuRe層析介質(zhì)做工藝開發(fā)的一般起始建議（未優(yōu)化）。

 

MabSelectTMSuRe 是一種Protein A層析介質(zhì)，耐受苛刻和具有成本效益的CIP程序，即0.1-0.5 M NaOH。

 

用于工藝開發(fā)的推薦途徑是使用高通量工藝開發(fā)(HTPD)--使用PreDictor™96孔板可以在短時間內(nèi)評估大量的層析參數(shù)（參考文獻1）。然后最佳工藝參數(shù)被放大，即HTPD→實驗室規(guī)�！�中試車間→生產(chǎn)。這種方法提供了大量的對于Quality by Design (QbD)方法尤其有用的數(shù)據(jù)。甚至當使用HTPD時，下一個表格中的一些信息可以作為起點使用。

 

 

大約總的循環(huán)時間*** ~ 17CV x 2.4 min/CV + 11CV x 3.4min/CV + 2 CV x 7.5 min/CV ~ 95min ~ 1.6小時。即使你做兩次，總時間大約為3.2小時。沒有生產(chǎn)中的限速步驟。

 

 

上樣準備-樣品在上樣到MabSelect SuRe層析柱前必須經(jīng)過過濾。至少必須使用無菌過濾器；另外，在無菌過濾前可以使用吸附深度過濾器。在細胞培養(yǎng)物收獲后，應(yīng)該盡快完成運行。在細胞培養(yǎng)物運行前需要被保存的情況，應(yīng)該經(jīng)過無菌過濾并保存在4℃，或者冷凍保存（如可能）。

 

Run #0–空白運行-為了去除非共價固定的配基，應(yīng)該在新的MabSelect SuRe層析介質(zhì)上第一輪運行前進行空白運行，從而減少層析期間的配基泄露。上面列出的層析方法的所有階段應(yīng)使用兩種變化-首先，在上樣階段應(yīng)使用平衡緩沖液（即不含蛋白質(zhì)），其次，空白運行的洗脫階段應(yīng)被設(shè)置為3個柱體積，且不受監(jiān)測功能的控制。

 

Run #1 –上樣條件-下一個實驗應(yīng)該運行以確定MabSelect SuRe層析柱在2.4-4.8分鐘保留時間內(nèi)對你的Mab的動態(tài)結(jié)合載量（DBC）。按照上述程序并使層析柱過載達到50 g/L，收集穿透組份，然后測定穿透組份中的Mab濃度，并計算5%穿透。

 

Run #2–設(shè)置上樣條件到5%穿透時80%動態(tài)載量，然后遵循上述所有步驟。如果這輪運行產(chǎn)生可接受的純度、質(zhì)量和產(chǎn)量水平，可以鎖定這里所使用的工藝。

 

分析-在調(diào)節(jié)到下一步的上樣條件和通過無菌過濾器過濾后，分析Protein A步驟樣品的純度和質(zhì)量。此外，在2或3步基于平臺工藝的層析步驟后，必須分析純度和質(zhì)量。如果上述導(dǎo)致洗脫組份中的低產(chǎn)量或高宿主細胞蛋白殘留（HCP），則須優(yōu)化清洗和洗脫條件完成進一步的工藝開發(fā)。

 

清洗條件-GE Healthcare已經(jīng)完成了各種清洗條件的探索研究。為了了解更多關(guān)于這些研究的信息，請向您當?shù)谿E Healthcare公司的代表索取《討論對于Protein A的中間清洗步驟》的科學海報（參考文獻3）。

 

洗脫條件-可以考慮各種洗脫條件，例如檸檬酸緩沖液（10-100 mM）或甘氨酸。當優(yōu)化洗脫條件用于更好的雜質(zhì)清除時，確定抗體有效解吸的最高pH，然而，這可能會增加洗脫組份體積。另外，設(shè)計洗脫條件以匹配用于病毒滅活所需要的pH，如下面所討論。

 

步驟持續(xù)時間-這里提到的所有的步驟持續(xù)時間只是象征性的，如果特定步驟中層析圖和收集指示時間，可以縮短實際步驟的持續(xù)時間。

 

病毒滅活-洗脫組份中的pH應(yīng)保持在3.6或更低至少持續(xù)30分鐘，用于適當?shù)牟《緶缁�。如果洗脫組份具有更高的pH，需要通過添加酸滴定或通過對洗脫緩沖液體積的進一步優(yōu)化降低pH。然后通過加入0.1 M NaOH調(diào)節(jié)pH，pH必須馬上被調(diào)整到最匹配下一步上樣條件。（例如對于陽離子交換為pH 5-6或?qū)τ贑apto adhere為pH 6-8）。在洗脫期間可能會發(fā)生沉淀，且一般發(fā)生在pH滴定后低pH病毒滅活期間。有可能沉淀包含脂類和微量Mab、HCP和Protein A。這種沉淀物可以使用無菌過濾器去除-必須選擇正確的過濾膜的孔徑-盡管生產(chǎn)中通常使用的過濾膜孔徑對于這一步已經(jīng)足夠大。

 

 

推薦的工藝開發(fā)途徑是采用HTPD和分析多個條件。本文件中提供的信息是基于以前的經(jīng)驗，并可以作為步驟開發(fā)的起點。為了獲得步驟或工藝開發(fā)的進一步幫助，請聯(lián)系您當?shù)氐腉E Healthcare銷售代表或GE Healthcare的Fast Trak部門。