高分辨熔解曲線突變檢測
高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）技術(shù)是近年來興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品的分析。該方法與其他遺傳分型技術(shù)相比具有靈敏度高、特異性好、成本低廉、高通量檢測的優(yōu)點，是進行突變檢測的迅速、廉價而有效的方法。
HRM原理
HRM是在PCR基礎(chǔ)上通過測定DNA雙鏈熔解曲線變化來檢測突變的方法，溶解曲線的變化取決于DNA序列、長度、GC含量，因此，可以通過飽和燃料監(jiān)控熔解曲線的變化來反映核酸性質(zhì)的差異，從而對樣品進行分析。
在雙鏈體的溶解曲線檢測時需要添加合適的染料，飽和染料例如SYBR Green在雙鏈解鏈過程中會發(fā)生重排，無法真實反映DNA熔解情況。不適用于需低溫解鏈的樣品而且不能檢測異源雙鏈體。因此不能用于熔解曲線的檢測。而LC Green是一種與DNA有更強的結(jié)合位點，對PCR抑制作用很小的飽和染料，已成功的用于HRM檢測中。
HRM操作簡便，在PCR結(jié)束后添加合適的染料，通過監(jiān)測升溫過程中熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況來實現(xiàn)的，在升溫過程中，雙鏈解開，熒光染料從解鏈的分子上釋放，同時熒光強度降低，所以通過熒光強度和曲線的變化上就可以判斷是否存在突變。
圖一：同源雙鏈體和異源雙鏈體的熔解曲線
圖二：HRM數(shù)據(jù)處理過程
HRM的特點和應(yīng)用
HRM應(yīng)用：
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檢測人類疾病相關(guān)基因中常染色體的顯隱性和X-連鎖
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鑒定人類腫瘤的體細(xì)胞突變，腫瘤樣品中篩選體細(xì)胞突變
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基因突變掃描：單堿基的改變、插入或缺失
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特定突變、多態(tài)性位點的篩選
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外顯子和短擴增子基因型掃描
HRM特點：
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靈敏度高：雜合子突變體的檢測的靈敏度可以達到100%，原則上數(shù)據(jù)分析時溫度升高后純合子或半合子的突變時檢測不到的，但實際上，許多純合子突變是可以檢測到的。如基因突變正好與x連鎖，可以在PCR之前加入已知野生型樣本來檢測半合子或純合子的突變。
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特異性好：HRM的特異性可以達到90-100%。短的擴增子特異性要更高
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不受堿基位點局限，適用范圍廣
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在封閉的試管內(nèi)進行，可降低污染操作簡單、
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成本低廉、時間少、誤差小、高通量檢測
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檢測的樣品范圍廣：HRM檢測片段范圍在38-1000bp不同來源的樣品都可以用于HRM如血粉、口腔細(xì)胞、冷凍的腫瘤樣品、也可用于酒精固定、福爾馬林固定或石蠟包埋的組織等，在人類遺傳性疾病的研究中，通常用周邊血液淋巴細(xì)胞中提取DNA，用于HRM分析。
HRM：實驗設(shè)計中需要考慮的問題
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高效的擴增方案的設(shè)計對于HRM的成功至關(guān)重要。最大的靈敏度和特異性有助于最佳的PCR結(jié)果的產(chǎn)生，同時擴增子的溶解特性對于結(jié)果也非常重要。這取決于引物的設(shè)計和引物的位置。
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在實驗結(jié)果中有時會出現(xiàn)假陽性，這時可以通過調(diào)整引物或者擴增參數(shù)避免出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。
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樣品的質(zhì)量對特異性有一定的影響，因此，進行HRM分析時要選用高質(zhì)量的樣品。
總結(jié)
HRM靈敏度高、特異性好
該方法是在封閉的試管內(nèi)進行，可降低污染，因此，該技術(shù)具有操作簡單、成本低廉、時間少、誤差小、高通量檢測的優(yōu)點。是進行突變掃描的首選方法。
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高分辨熔解曲線 HRM 突變檢測
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