利用LightScanner上的高分辨熔解曲線進(jìn)行DNA甲基化位點(diǎn)檢測(cè)的靈敏性

引言

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳CpG二核苷酸修飾形式，異常的DNA甲基化模式發(fā)生在許多基因啟動(dòng)子的CpG島，這會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。CpG島高甲基化常導(dǎo)致基因沉默，與癌癥、老化、基因印記、X-染色體失活密切相關(guān)，此外，全基因組CpG高甲基化中也證實(shí)了發(fā)生在腫瘤形成的早期。傳統(tǒng)的檢測(cè)甲基化位點(diǎn)的方法是通過(guò)重亞硫酸鹽處理，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏�，然后進(jìn)行直接測(cè)序。甲基化的胞嘧啶沒有發(fā)生改變，因此通過(guò)測(cè)序很容易識(shí)別。本研究中我們系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了通過(guò)LightScanner的高分辨溶解曲線檢測(cè)甲基化的可靠性。如果這種方法在檢測(cè)甲基化中是可靠且靈敏度高，就可以減少測(cè)序的繁瑣過(guò)程。

未處理的和經(jīng)過(guò)SssI處理的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒用Qiagen EpiTect試劑盒進(jìn)行重亞硫酸鹽。通過(guò)對(duì)有代表性的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，確保樣品完全甲基化以及亞硫酸鹽處理。引物設(shè)計(jì)在擴(kuò)增片段大小在79-216bp的含有1-8個(gè)CpG位點(diǎn)的7個(gè)不同的片段。100%甲基化的和未甲基化的樣品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的樣品可以明顯的區(qū)分開。當(dāng)兩個(gè)樣品按以上比例混合后，熔解曲線表現(xiàn)出重復(fù)的劑量放映關(guān)系，當(dāng)50%混合時(shí)與未甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品偏性最大。高分辨溶解曲線的靈敏度足夠檢測(cè)甲基化位點(diǎn)，對(duì)小片段的靈敏度可達(dá)到2%,大片段的可以10%。

重要的DNA甲基化位點(diǎn)顯示在B淋巴細(xì)胞增生性疾病，如慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）中。瘤抑制基因的外部沉默可以通過(guò)DNA甲基化抑制劑處理而發(fā)生轉(zhuǎn)變。本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG島上游甲基化位點(diǎn)用Vidaza或Cladribine處理，重亞硫酸鹽處理的CpG甲基化變化的最高的進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后用LightScanner進(jìn)行高分辨溶解曲線分析。樣品經(jīng)亞硫酸鹽處理后有不同的的胞嘧啶的轉(zhuǎn)換，然后通過(guò)單獨(dú)和混合后分析檢測(cè)的靈敏性。不同克隆之間只要有意個(gè)被保留的C就可以在異源或同源混合的樣品中區(qū)分開。這一結(jié)果證實(shí)了高分辨熔解曲線是檢測(cè)甲基化位點(diǎn)的簡(jiǎn)單且靈敏度高的方法。

圖1：使用Sssl甲基化酶使2.9Kb的pBluescript CpG甲基化。甲基化的和非甲基化的樣品都使用Qiagen EpiTect Kit進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Lightscanner檢測(cè)，最后通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。

圖1A：重亞硫酸鹽處理的100%甲基化的和100%非甲基化的四個(gè)片段。

圖1B：79-216bp的有2-8個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化的和非甲基化的片段進(jìn)行不同比例的混合。對(duì)CpG較少的小片段的檢測(cè)的靈敏度在2%，有較多CpGs的大片段的檢測(cè)的靈敏度在10%。

圖1C：包含一個(gè)CpG位點(diǎn)的110bp，甲基化和非甲基化的樣品按不同比例混合。（8個(gè)重復(fù)）

圖2：甲基化抑制劑處理患者CpG島

下圖為用甲基抑制劑Vidaza或Cladribine處理前后microRNA195（269bp）的上游CpG島甲基化位點(diǎn)的變化

圖3：miR-195 CpG島的269bp擴(kuò)增區(qū)

兩個(gè)不同的病人的CpG位點(diǎn)見下表

圖4：miR-195 CpG島的150bp擴(kuò)增區(qū)

圖5：從4個(gè)CLL患者中克隆miR-195可能調(diào)控區(qū)，使用Qiagen EpiTect Kit進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，之后PCR擴(kuò)增，Lightscanner檢測(cè)，測(cè)序。不同的患者采取不同的甲基化模式擴(kuò)增（0-8 Cs）。熔解曲線是含有18 CpG位點(diǎn)的269bp的片段（A）和含有5 CpG位點(diǎn)的150bp的片段（B）。

圖6：等量混合不同患者的進(jìn)行不同甲基化模式的克隆，并擴(kuò)增了含有5CpG的150bp的片段。使用甲基抑制劑處理前后進(jìn)行甲基化和未甲基化控制的比較，熔解曲線分別為患者P3（A），P4（B），V1（C），V3（D）。

圖7：甲基化的和非甲基化的DNA樣品按不同的比例混合，150bp的片段含有5和CpG位點(diǎn)。

總結(jié)

用不同的DNA甲基化模式來(lái)評(píng)價(jià)LightScanner 高分辨熔解曲線的能力。用質(zhì)�？刂坪�100%甲基化的和未甲基化的部分表現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系，50%混合后與未甲基化的偏離程度最大。分析結(jié)果證明對(duì)小片段的甲基化檢測(cè)的靈敏度在2%，大片段的靈敏度在10%。
在CLL分析中，經(jīng)過(guò)甲基抑制劑處理后檢測(cè)患者miR-195基因CpG島的甲基化位點(diǎn)。不同克隆之間只要有意個(gè)被保留的C就可以在異源或同源混合的樣品中區(qū)分開。結(jié)論證實(shí)了使用高分辨溶解曲線是檢測(cè)甲基化位點(diǎn)簡(jiǎn)單且靈敏的方法。