Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量測(cè)序技術(shù)原理

2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》雜志以里程碑事件報(bào)道，開創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序的先河。2007年又推出了性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列試劑和軟件，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準(zhǔn)確性和讀長(zhǎng)也進(jìn)一步提升。

GS FLX 測(cè)序原理

GS FLX系統(tǒng)的測(cè)序原理和GS 20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來 (圖 1)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化的特點(diǎn)。

Roche GS FLX System是一種基于焦磷酸測(cè)序原理而建立起來的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)。在測(cè)序時(shí)，使用了一種叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個(gè)由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物。測(cè)序開始時(shí)，放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在各種酶的作用下，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。

圖1：GS FLX 高通量測(cè)序方法原理示意圖

測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；

2、Emulsion  PCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而不受其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)；

3、測(cè)序反應(yīng)：攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測(cè)序開始。每一個(gè)與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，并被CCD照相機(jī)所捕獲；

4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過4-6億個(gè)堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

技術(shù)特點(diǎn)：

• 速度快，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)耗時(shí)10個(gè)小時(shí)，獲得4-6億個(gè)堿基對(duì)。比傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序的方法快100倍；

• 讀長(zhǎng)長(zhǎng)，單個(gè)序列的讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，平均可達(dá)到450個(gè)堿基左右；

• 通量高，每個(gè)反應(yīng)可以得到超過100萬個(gè)序列讀長(zhǎng)，成本大大降低；

• 準(zhǔn)確度高，讀長(zhǎng)超過400bp時(shí)，單一讀長(zhǎng)的準(zhǔn)確性可以超過99%；

• 一致性好，測(cè)序結(jié)果一致性超過99.99%；

• 可以進(jìn)行Pair－End測(cè)序研究；

• 簡(jiǎn)便高效，不需要進(jìn)行建庫、克隆挑取、質(zhì)粒提取等工作，一個(gè)人可以在一天內(nèi)完成一個(gè)微生物物種的測(cè)序工作。

GS FLX系統(tǒng)的應(yīng)用

自從2005年底GS 超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)問世以來，已經(jīng)相繼在世界上各大測(cè)序?qū)嶒?yàn)室成功落戶。這項(xiàng)技術(shù)的第一個(gè)“試驗(yàn)品”就是來自有“DNA之父”之稱的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液樣本。目前GS系統(tǒng)的用戶在Nature，Science，PNAS等世界頂級(jí)的期刊雜志上已經(jīng)發(fā)表了五十多篇的學(xué)術(shù)論文。（詳細(xì)列表請(qǐng)查詢https://www.roche-applied-science.com/sis/sequencing/genome/index.jsp）。與GS 20系統(tǒng)相比較，硬件配置和軟件系統(tǒng)方面的革新改進(jìn)，使得GS FLX系統(tǒng)具有了廣泛的應(yīng)用：

全基因組測(cè)序

多達(dá)120 Mb的未知基因組的測(cè)序

－生成基因組結(jié)構(gòu)概圖

－研究DNA序列的組織，分布和信息

－基因篩查：尋找新基因，定位和功能

－和其他基因組進(jìn)行比較研究

全基因組進(jìn)行從頭鳥槍法測(cè)序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆測(cè)序。

比較基因組研究

－識(shí)別單堿基突變

－識(shí)別突變熱點(diǎn)和保守區(qū)域

－識(shí)別插入或者缺失的基因

－斷定基因型和表型之間的相關(guān)關(guān)系（比如，研究藥物抗性的遺傳基礎(chǔ)）

－ 基于基因測(cè)序變化進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)

－進(jìn)行流行病學(xué)分析

－了解工業(yè)生產(chǎn)菌株和它們的親代菌株序列上的差異作為進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)菌株開發(fā)的遺傳基礎(chǔ)

－進(jìn)行宏基因組 （metagenomics）研究

－古代化石DNA 測(cè)序研究

利用配對(duì)末端方法（Pair-End Tag）將Contigs拼接成Scaffolds。

轉(zhuǎn)錄組和基因調(diào)節(jié)研究

基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序列的高通量轉(zhuǎn)錄組分析，或者miRNA 序列的基因組范圍識(shí)別，小分子和非編碼RNA的測(cè)序。

研究DNA的甲基化模式來進(jìn)行基因調(diào)節(jié)的研究。

擴(kuò)增產(chǎn)物分析

PCR產(chǎn)物的超精細(xì)測(cè)序（應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的重測(cè)序）

－在混合的腫瘤樣本中識(shí)別體細(xì)胞突變

－在群體水平上發(fā)現(xiàn)高可信度的SNP位點(diǎn)