高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。

自從2005年454 Life Sciences公司（2007年該公司被Roche正式收購）推出了454 FLX焦磷酸測序平臺（454 FLX pyrosequencing platform）以來，曾推出過3730xl DNA測序儀（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）這家一直占據(jù)著測序市場最大份額的公司的領(lǐng)先地位就開始動搖了，因為他們的拳頭產(chǎn)品毛細管陣列電泳測序儀系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了兩個強有力的競爭對手，一個就是羅氏公司(Roche)的454 測序儀(Roche GS FLX sequencer)，，另一個就是2006年美國Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺（Genome Analyzer platform），為此，2007年ABI公司推出了自主研發(fā)的SOLiD 測序儀(ABI SOLiD sequencer)。這三個測序平臺即為目前高通量測序平臺的代表。（見表一）

表一：主流測序平臺一覽

這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對于傳統(tǒng)測序的96道毛細管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列。讀取長度根據(jù)平臺不同從25bp到450bp，不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1G到14G不等的堿基數(shù)，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序儀所不能比擬的。盡管如此，在這項新的劃時代的測序技術(shù)剛出現(xiàn)的時候，科學(xué)界對這項新技術(shù)卻并不熱衷。許多習(xí)慣用桑格技術(shù)的科學(xué)家懷疑新技術(shù)的準(zhǔn)確度、閱讀能力、成本消費、實用性。代理Sanger型測序硬件的經(jīng)銷商害怕其投資失敗而首先提出了這些懷疑。

圖一：在芯片上進行的測序：Illumina測序平臺

然而大多數(shù)人卻忽略了一個事實，即桑格技術(shù)的普及最初也遇到同樣的阻礙。桑格技術(shù)剛開發(fā)出來時，閱讀能力很難超過25bp，即使在Fred Sanger雙脫氧終止法發(fā)明后也只達到80bp，如今卻達到了750bp；而新發(fā)展的合成測序技術(shù)，應(yīng)用焦磷酸測序方法，其閱讀能力最初只有100bp，推向市場16個月后增加至250bp，隨著技術(shù)的不斷完善，目前已達到了400bp，很快就接近桑格技術(shù)目前的水平。除了閱讀能力外，能否以有限的成本用一臺儀器產(chǎn)生足夠數(shù)量的序列標(biāo)記也是另一個需要改善的重要問題。這個問題已經(jīng)被Roche公司解決了，應(yīng)用他們的系統(tǒng)，僅花費閱讀35bp或者更小片段的成本就能產(chǎn)生比35bp多10倍的序列標(biāo)記。

       圖二：GS FLX 高通量測序方法原理示意圖

  一、高通量測序的應(yīng)用

高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差。 依靠后期強大的生物信息學(xué)分析能力，對照一個參比基因組(reference genome)高通量測序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測序(re-sequence)，2007年van Orsouw等人結(jié)合改進的AFLP 技術(shù)和454 測序技術(shù)對玉米基因組進行了重測序，該重測序?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)的超過75%的SNP位點能夠用SNPWave技術(shù)驗證，提供了一條對復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。2008年Hillier對線蟲CB4858 品系進行Solexa重測序，尋找線蟲基因組中的SNP位點和單位點的缺失或擴增。但是也應(yīng)該看到，由于高通量測序讀取長度的限制，使其在對未知基因組進行從頭測序(novo sequencing)的應(yīng)用受到限制，這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測序(讀取長度達到850 堿基)的協(xié)助。但是這并不影響高通量測序技術(shù)在全基因組mRNA表達譜，microRNA表達譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用。

2008年Mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了RNA 深度測序，這項工作展示了深度測序在轉(zhuǎn)錄組研究上的兩大進展，表達計數(shù)和序列分析。對測得的每條序列進行計數(shù)獲得每個特定轉(zhuǎn)錄本的表達量，是一種數(shù)碼化的表達譜檢測，能檢測到豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本。分析測得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報道過的RNA剪切形式，3’端非翻譯區(qū)，變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小RNA 前體，發(fā)現(xiàn)至少有3500個基因擁有不止一種剪切形式。而這些信息無論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。

高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據(jù)“不浪費”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲中獲得了40 萬個序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了18個新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。 

在DNA—蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀—深度測序(ChIP-seq)實驗也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA 直接進行測序，對比ref seq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點、結(jié)合位點內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。

      圖 三: Independent Flow Cells（SoLid^TM System）

二、高通量測序的前景

目前，大多分析家都無法相信新一代測序技術(shù)能完全取代目前的芯片測序技術(shù)。不過，有些分析家也的確認(rèn)為芯片測序技術(shù)正面臨著挑戰(zhàn)，他們認(rèn)為到了2012年新一代的測序技術(shù)將會帶來高達2。15億美元的產(chǎn)值。

2006年，整個芯片測序市場大概價值8億美元，其中65%的市場份額都是有關(guān)基因表達譜分析產(chǎn)品的，剩下35%的市場份額則由基因型分析芯片占據(jù)。不過美國哈佛大學(xué)（Harvard University）遺傳學(xué)教授George Church認(rèn)為，這部分市場也會受到新一代測序技術(shù)的沖擊。重測序芯片（resequencing arrays）、單核苷酸多態(tài)性分析芯片以及基因拷貝數(shù)目變異分析芯（copy number variant array）市場也會受到影響。也有分析家不贊同這個觀點，他們認(rèn)為即使新一代測序技術(shù)很便宜，還是有不少人會選擇傳統(tǒng)的測序儀的。

新一代測序技術(shù)相對傳統(tǒng)芯片測序技術(shù)的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷手段的推廣才能獲得大眾的認(rèn)可。去年夏天，由Frost & Sullivan公司對學(xué)術(shù)科研機構(gòu)和私人研究團體進行的一項調(diào)查研究結(jié)果表明，在實際應(yīng)用領(lǐng)域，例如進行表達譜分析時，人們還是傾向于選擇傳統(tǒng)的芯片產(chǎn)品，而并非青睞新一代的測序產(chǎn)品。

新一代測序儀推廣困難可能由其價格昂貴導(dǎo)致。平均采購一臺新一代測序儀大約要花費50萬美元，除非該實驗室測序的工作量非常大，否則是不會考慮購買的。即使像Polonator這樣的新一代測序儀也需要花費15萬美元左右，這筆費用對于一個小實驗室來說是無法承受的。這時，只需要150美元一塊的芯片就非常有競爭力了。以基因芯片產(chǎn)品享譽業(yè)界的美國Affymetrix公司市場部副總裁Jay Kaufman認(rèn)為，新一代測序技術(shù)對于芯片市場來說的確會帶來一定的沖擊，不過要完全取代表達譜分析芯片還需要一定的時間。

但是，基因芯片也有其自身的缺點，就在于它是一個“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測序的強項， 就在于它是一個“開放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。 研究者可以充分享受這兩個平臺的比較優(yōu)勢，在獲取新信息的基礎(chǔ)上，利用芯片的強項， 即對已知信息的高通量、低成本(相對)的檢測能力， 對大量樣品進行快速檢測，短時間內(nèi)獲得有大量有效的數(shù)據(jù)。

作為兩個高通量的基因組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面存在重疊和競爭，但是在更多方面是優(yōu)勢互補，兩種方法聯(lián)合使用，將解決以前的單種技術(shù)難以解決的問題。

三、結(jié)語

新一代測序已顯示出巨大的潛力。也正是因為科學(xué)的不斷進步，在給測序技術(shù)提出新要求的時候，也給這項技術(shù)帶來了新的增長點：

2008年4月Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù)，也被稱為第三代測序技術(shù)，并利用該技術(shù)對一個M13病毒基因組進行重測序。這項技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序，是因為它完全跨過了上述3種高通量測序依賴的基于PCR擴增的信號放大過程，真正達到了讀取單個熒光分子的能力，向1000美元測定一個人類基因組的目標(biāo)邁出了一大步。