來源：生命科學(xué) 關(guān) 薇, 王 建, 賀福初*（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）
  摘　要：隨著2000 年酵母大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜的成功描繪，蛋白質(zhì)相互作用特別是大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究成為生命科學(xué)領(lǐng)域的又一個研究熱點(diǎn)。酵母、果蠅、線蟲以及人類蛋白的大規(guī)模相互作用圖譜的相繼完成，不僅對系統(tǒng)研究細(xì)胞內(nèi)各種生命活動有著重要意義，也標(biāo)志著蛋白質(zhì)相互作用研究方法的不斷發(fā)展和完善。本文綜述了當(dāng)前大規(guī)模研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)方法并進(jìn)行了比較分析。每種技術(shù)都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)中要根據(jù)不同的要求和目的選擇適宜的方法。
  關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)相互作用；酵母雙雜交；串聯(lián)親和純化
  The advance in research methods for large-scale protein-protein interactions
  GUAN Wei, WANG Jian, HE Fu-Chu*
  (Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China)
  Abstract: In 2000, the first network of large-scale protein-protein
  interactions was accomplished in yeast. It was a historic moment and became
  another hot spot of protein research. Subsequently, such proteins interaction
  maps were also brought to success in the fly, worm and even human during five
  years. So rapid progress in large-scale protein-protein interactions turned up
  many new angles of view for investigating the mechanisms of cell functions,
  actually it also suggested the development and complement of research method
  itself. In this article we summarized the progress of techniques in
  large-scale protein-protein interactions and showed their differences. Anyway,
  the researchers should choose right means to perform their diverse intentions.
  Key words: protein-protein interaction; yeast two hybrid; tandem affinity
  purification
  人類基因組測序的完成標(biāo)志著一個新的生物學(xué)研究時代——后基因組時代(post-genomic era)的來臨。科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)又回到蛋白質(zhì)上，全基因組的序列信息并不足以解釋及推測細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象，蛋白質(zhì)才是細(xì)胞活性及功能的最終執(zhí)行者。構(gòu)成細(xì)胞的所有組成蛋白有多少；他們的動態(tài)相互作用關(guān)系又如何；細(xì)胞內(nèi)所有蛋白即蛋白質(zhì)組又是怎樣組織在一起形成有功能、有秩序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)？
  這些問題的解決才是最終闡明細(xì)胞中各種生命活動機(jī)制的關(guān)鍵所在[1]。
  1　大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究的目的及意義
  生物體內(nèi)各種生命信息由不同的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯傳遞到相應(yīng)的蛋白質(zhì)上并使其具有各自的生化特性及生物學(xué)活性；但每個蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立的在細(xì)胞中完成被賦予的功能，它們在細(xì)胞中通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成大的復(fù)合體，在特定的時間和空間內(nèi)完成特定的功能，而且有些蛋白質(zhì)的功能只有在復(fù)合體形成后才能發(fā)揮出來，如依賴于構(gòu)象變化或翻譯后修飾的蛋白質(zhì)功能[2]
  ；另一方面，某些蛋白質(zhì)可能參與了不止一個的復(fù)合體，簡單的兩兩相互作用研究就不足以闡明這種更為復(fù)雜的相互作用，因此，大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)相互作用研究應(yīng)運(yùn)而生，其目的是在細(xì)胞的特定生理?xiàng)l件下，從一個蛋白到多個蛋白，從一個復(fù)合體到多個復(fù)合體，進(jìn)而描繪出整個蛋白質(zhì)組中蛋白間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖�；�于這些作用關(guān)系，科學(xué)家們才能從真正意義上闡明一個蛋白質(zhì)的功能，才有可能研究細(xì)胞中某一生理活動中所有相關(guān)蛋白質(zhì)的變化及作用機(jī)制。大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用的研究還有助于了解細(xì)胞中不同生命活動之間的相互關(guān)系。
  2　大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用的研究策略及方法
  研究蛋白質(zhì)相互作用時要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皸l件選擇不同的實(shí)施策略。研究已知蛋白間的相互作用人們關(guān)注的是蛋白間能否發(fā)生結(jié)合，實(shí)驗(yàn)本身更趨向于驗(yàn)證性，因此，應(yīng)選擇操作性強(qiáng)、可信度高、接近生理?xiàng)l件的技術(shù)方法，盡量減少實(shí)驗(yàn)本身帶來的假陰性或假陽性。若研究者想得到細(xì)胞中能與某一蛋白結(jié)合的所有未知蛋白質(zhì)，則實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是得到細(xì)胞中含有靶蛋白的復(fù)合體，經(jīng)過有效地分離純化后，逐一鑒定復(fù)合物中的各個組分；或者采用一對多的篩選方法，如酵母雙雜交，在建立的蛋白表達(dá)文庫中檢測可能與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。值得注意的是在這一策略中實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證是必不可少的。目前用于大規(guī)模研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法包括酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化、質(zhì)譜鑒定、蛋白芯片以及基于生物信息學(xué)的分析方法等。
  2.1　酵母雙雜交　該系統(tǒng)由Fields 和Song[3]首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時建立。利用真核生長轉(zhuǎn)錄因子的兩個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbinding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain)，分別與目標(biāo)蛋白X 及可能與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白Y 相連，并共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。如果蛋白X與Y能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來分開的兩部分結(jié)合，形成完整的活性形式從而激活下游報告基因。通過檢測報告基因的表達(dá)產(chǎn)物就可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用[4~5]。
  這一經(jīng)典的蛋白相互作用研究方法接近于體內(nèi)環(huán)境，那些瞬時、不穩(wěn)定的兩兩相互作用也可以被檢測到，并且與內(nèi)源蛋白的表達(dá)無關(guān)[6]。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)并結(jié)合簡便高效的Gateway表達(dá)載體構(gòu)建方法[7]，在大規(guī)模的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用研究中酵母雙雜交系統(tǒng)得到了最為廣泛的應(yīng)用。Rain 等[8]用該法繪制了人類胃腸道病原菌Helicobacter pylori 的大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用圖譜。在261 種蛋白中，確立了 1200 種相互作用關(guān)系，涵蓋了整個蛋白質(zhì)組得46. 6%。隨后，Giot 等[9]和Li 等[10]在果蠅和線蟲中也成功地研究了大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用。除了對模式生物的研究外，Stelzl 等[11]和Raul 等[12]則先后分析了人腦組織、人已知ORF中大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。但酵母雙雜交方法本身也有一定的局限性：(1)不能研究具有自激活特性的蛋白質(zhì)；(2)只能檢測兩個蛋白間的相互作用；(3)檢測的相互作用需發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，對于不能定位到細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)無法研究；(4)大部分實(shí)驗(yàn)中有將近50%的假陽性率，且推測的相互作用僅有3% 在兩種以上的實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。為了彌補(bǔ)方法本身的缺點(diǎn)及局限性，研究者也不斷地對其進(jìn)行完善和改進(jìn)。Stelzl 等[11]在研究中就采用了以下的策略：(1)選擇不同功能、不同大小的蛋白作為誘餌，以確保所選靶蛋白在整個蛋白質(zhì)組中的代表性；(2)篩選過程中采用兩輪雜交的方法：第一輪以混合誘餌(8 個)對文庫進(jìn)行篩選，結(jié)果呈陽性的克隆再進(jìn)行一對一的第二輪雜交，這樣既降低了工作量又提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；(3)pull-down，免疫共沉淀對酵母雙雜交的結(jié)果進(jìn)行體內(nèi)的相互作用驗(yàn)證；(4)利用生物信息學(xué)的方法對結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析，包括基因的染色體定位、蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析等，從多方面分析結(jié)果的可信度。據(jù)此，他們最終確認(rèn)了911 對高可信度的相互作用涉及到401 種蛋白，數(shù)據(jù)分析中設(shè)立了6 個標(biāo)準(zhǔn)來判定得到的結(jié)果，大大提高了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

2.2　串聯(lián)親和純化　Rigaut 等[13]首次采用串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandem affinity
  purification，TAP)研究了蛋白間的相互作用，與其他融合標(biāo)簽方法的最大不同是該方法選用了兩個連續(xù)的標(biāo)簽而不是通常意義上的一個。標(biāo)簽共分三部分：蛋白A 、C B P (calmodulin binding peptide，鈣調(diào)素結(jié)合多肽)和中間連接的TEV 酶識別的酶切位點(diǎn)。帶有TAP 標(biāo)簽的融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)與內(nèi)源相互作用蛋白形成復(fù)合物，細(xì)胞裂解后經(jīng)IgG 偶聯(lián)的層析柱純化，蛋白A 與IgG 特異結(jié)合，從而使含有標(biāo)簽的復(fù)合物得到第一次純化。為了除去與柱填料非特異結(jié)合的蛋白，用TEV 酶切割分離蛋白A 標(biāo)簽，使含有靶蛋白的復(fù)合物與層析柱分離并經(jīng)過鈣調(diào)素偶聯(lián)的親和層析柱進(jìn)行第二次純化，靶蛋白上的CBP標(biāo)簽可與鈣調(diào)素結(jié)合；在加入過量螯合劑EGTA后CBP 與親和層析柱分離使含有靶蛋白的復(fù)合體得到分離純化， 經(jīng)SDS-PAGE，復(fù)合物中的各個蛋白被分開，切膠、胰酶消化后，即可通過質(zhì)譜鑒定復(fù)合物中各個蛋白的氨基酸序列(圖1)。該方法的優(yōu)點(diǎn)：(1)不需要過多的背景知識就可以得到大量含靶蛋白的復(fù)合體；(2)蛋白表達(dá)及與復(fù)合物的結(jié)合都接近生理水平，是一種檢測體內(nèi)蛋白相互作用的方法；(3)TAP 采用兩步親和純化，提高了純化產(chǎn)物的特異性。一般在2L 的酵母培養(yǎng)基中(細(xì)胞濕重約10g)可以分離純化得到足夠一維電泳及質(zhì)譜分析的蛋白復(fù)合物[ 1 5 ] 。Gavin 等 [16]采用TAP 結(jié)合質(zhì)譜鑒定，對啤酒酵母的多蛋白復(fù)合物進(jìn)行了大規(guī)模的研究。共分析了 1 739 個基因其中與人類基因相關(guān)的有1 143 個，純化了589 種蛋白，經(jīng)生物信息學(xué)分析，它們分屬于 232 個不同的多蛋白復(fù)合體；在細(xì)胞中具有新功能的為344 個，231 個蛋白的功能以前未見報道。由于TAP/MS方法的高靈敏性使得僅有15個拷貝的蛋白也能被檢測到，鑒定的蛋白分子量從6.6kDa 到 559kDa，等電點(diǎn)從3.9 到12.4。這一研究提供了真核生物中二元以上的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，從中得到的有關(guān)其功能的各種信息也能為藥物的篩選提供依據(jù)。TAP 技術(shù)的出現(xiàn)有效地促進(jìn)了酵母中大規(guī)模的蛋白鑒定和純化工作，但是其在高等真核生物中的應(yīng)用卻處于滯后狀態(tài)，這是因?yàn)樵谡婧思?xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源靶蛋白與帶有標(biāo)簽的蛋白會發(fā)生競爭作用，影響相互作用的研究。因此，F(xiàn)orler 等[17]將RNAi 與TAP 技術(shù)聯(lián)用在果蠅的S2 細(xì)胞(Drosoph ila melanogaster)中研究了蛋白質(zhì)間的相互作用，該策略避免了內(nèi)源蛋白的干擾，進(jìn)而從高等真核細(xì)胞中分離并鑒定了相應(yīng)的蛋白復(fù)合體，實(shí)驗(yàn)表明，蛋白純化的特異性及有效性均得到提高，采用這種方法他們還對靶蛋白生物功能進(jìn)行了分析。iTAP(TAP 與RNAi)保持了TAP 方法在原核生物中應(yīng)用的一些優(yōu)勢：(1)基于標(biāo)簽的親和純化方法；(2)用TAP 標(biāo)記的蛋白替代內(nèi)源基因表達(dá)產(chǎn)物；但由基因本身的啟動子調(diào)控蛋白的表達(dá)量，這一點(diǎn)在真核細(xì)胞中還無法實(shí)現(xiàn)。對于這部分相互作用的研究，人們多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將帶有標(biāo)簽的靶蛋白引入細(xì)胞中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠穩(wěn)定的整合在宿主細(xì)胞的基因組中并且拷貝量較低，因此，外源蛋白可以近似于生理水平的低表達(dá)，進(jìn)而避免由于高表達(dá)而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。此外Zhou等[18]在原代細(xì)胞中做了有益的嘗試，將TAP標(biāo)簽通過基因敲入技術(shù)引入小鼠中，使得該技術(shù)能夠應(yīng)用于更多的基因并進(jìn)行組織或細(xì)胞類型特異的復(fù)合體研究。

圖1　TAP親和層析純化原理[14]
  注：A:標(biāo)簽中的ProteinA 與固化的IgG 結(jié)合緩沖液淋洗去除不能結(jié)合的雜蛋白，TEV 酶切分離ProteinA
  和靶蛋白；B:利用CBP(Calmodulin binding peptide)-Calmodulin
  的相互作用進(jìn)一步純化復(fù)合物，緩沖液洗去雜蛋白。加入過量的螯合劑(EGTA)螯合Ca2+，使純化的復(fù)合物與層析柱分離。
  TAP 純化時存在蛋白污染問題，很難判斷這些蛋白是真正的相互作用，還是蛋白處理過程中的副產(chǎn)品。為此，有人建議用三標(biāo)簽的方法[19]，但實(shí)驗(yàn)表明該法也不能排除蛋白的污染。其他標(biāo)簽也有應(yīng)用，比較流行的是Flag[20]。GST、His6、生物素等也分別用于蛋白純化，但由于他們有限的親和力及較高的背景，在大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用研究中未得到廣泛應(yīng)用。選擇何種標(biāo)簽也許是個難題，每種標(biāo)簽都有自身的弱點(diǎn)：大標(biāo)簽適于規(guī)模較大的相互作用研究，但可能影響蛋白的正常折疊和功能；小標(biāo)簽可能會更大程度的保持蛋白本身的特性，但在表達(dá)純化時通常含量較低[21]

2.3　質(zhì)譜在蛋白質(zhì)相互作用分析中的應(yīng)用　在蛋白質(zhì)相互作用的研究中，質(zhì)譜最初只是作為鑒定蛋白質(zhì)的一種快速、高效的方法：混合的蛋白樣品首先經(jīng)過純化分離、然后通過SDS-PAGE
  將復(fù)合體中的組分分開，隨后對感興趣的蛋白進(jìn)行酶解；得到的肽段在質(zhì)譜中進(jìn)行鑒定，從而確定樣品中的目標(biāo)蛋白；但由于分離方法的靈敏度及技術(shù)本身的局限，對于那些相互作用較弱、分子量較大或偏堿性的蛋白往往不能達(dá)到理想的分析效果，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性。定量蛋白質(zhì)組技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一問題，而該技術(shù)的策略正是較好的利用了質(zhì)譜的高靈敏度。目前已有許多種研究蛋白相互作用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，以下就穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法為例進(jìn)行說明。穩(wěn)定的同位素之間具有“輕”、“重” 之分，而其化學(xué)性質(zhì)又保持相同，這就使得有同位素標(biāo)記的蛋白在分離純化時具有相同的特性，而在隨后的質(zhì)譜鑒定中又能根據(jù)質(zhì)量數(shù)的差異被區(qū)分開。通常采用的同位素標(biāo)記為2H、13C、15N 以及 18O。加入同位素標(biāo)記的方法主要分為：代謝標(biāo)記法(stable isotope-labelled animo acids in cell culture， SILAC)和化學(xué)標(biāo)記法(isotope-coded affinity tagging，  ICAT)。前者是在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中加入同位素標(biāo)記(體內(nèi)標(biāo)記) ；后者則是在提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白并經(jīng)過親和純化后加入同位素標(biāo)記(體外標(biāo)記)。最后兩種方法都將得到的對照及實(shí)驗(yàn)組樣品混合，進(jìn)行質(zhì)譜分析。由于同位素“ 輕”、“重” 差異， 質(zhì)譜能很容易的區(qū)分并鑒定實(shí)驗(yàn)組中特異的蛋白質(zhì)。該方法中，親和純化過程是最大限度的保留實(shí)驗(yàn)組中的差異蛋白而非排除污染蛋白，系統(tǒng)本身的靈敏度在質(zhì)譜分析中得到保證，這就避免了傳統(tǒng)的定性蛋白質(zhì)組技術(shù)中分離方法本身固有的局限性，大大提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。Blagoev等[22]采用SILAC 策略研究了在EGF 刺激細(xì)胞后，能夠與 Grb2  的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的相互作用蛋白。兩組細(xì)胞分別在含有不同同位素(12C-Arg,13C-Arg)的培養(yǎng)基中生長一段時間，EGF 刺激其中一組細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)10 分鐘，隨后兩組細(xì)胞同時裂解、純化并進(jìn)行LC-MS/ MS 分析。最終228 個蛋白得到鑒定，其中28 個蛋白在被刺激的實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)水平明顯高于對照組。這些蛋白除了已知的信號分子外，還有一些蛋白參與了信號衰減或具有細(xì)胞骨架的功能，此外還鑒定到了未知蛋白質(zhì)。這表明該方法在研究信號通路中具有較大的潛力，值得一提的是，DNA、RNA、金屬離子或代謝產(chǎn)物等小分子也參與了某些蛋白間的相互作用，進(jìn)行蛋白活性的調(diào)節(jié)，或直接與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，酵母雙雜交、TAP 等方法對這類相互作用似乎無能為力，而基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法則能繼續(xù)發(fā)揮其自身優(yōu)勢。
  2.4 蛋白質(zhì)芯片　蛋白芯質(zhì)片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光抗菌素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，并最終達(dá)到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的。Zhu 等[23]置備了高密度的酵母蛋白質(zhì)芯片，涵蓋了近5 800 種蛋白，用以研究鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。理論上蛋白芯片除了可以研究蛋白間的相互作用外，還可以研究蛋白- 脂類、蛋白- 核酸以及蛋白-  配體間的結(jié)合，但目前應(yīng)用還不夠廣泛，僅用于CaM、磷脂相互作用蛋白、結(jié)構(gòu)域之間以及抗原與抗體的相互作用研究等[23~26]。隨后，Ptacek 等[27]還研究了酵母激酶的相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)了近4 000 個磷酸化反應(yīng)，涉及到1 325 種不同的蛋白 。
  2.5　基于生物信息學(xué)的分析方法　生物信息學(xué)的方法大都基于從已知數(shù)據(jù)庫中分析比較未知蛋白的功能及其相關(guān)的相互作用蛋白，已知的數(shù)據(jù)庫包括細(xì)菌、酵母的全部基因序列或已知的相互作用蛋白。比較基因簇的同源性推測蛋白功能(conserved gene neighborhood, GN )[28~29]，相關(guān)基因具有相似的系統(tǒng)發(fā)生模式(co-occurrence of genes, CO)[30]，相互作用蛋白的基因可能相互融合(gene fusion events, GF)[31~32] 等，以這些為依據(jù)采用適合的軟件就可對大規(guī)模的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行分析，目前已有許多網(wǎng)站開發(fā)了這樣的功能(表1)。生物信息學(xué)分析無需具體的實(shí)驗(yàn)操作，往往是在整個基因組規(guī)模上進(jìn)行研究，可獲得較大的信息量。另外根據(jù)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，也可以推測蛋白間可能的相互作用，但遺憾的是這些方法以基因的同源性為前提，若數(shù)據(jù)庫中沒有同源基因則無法比較。目前大規(guī)模研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)都沒有達(dá)到飽和，整合所有的研究數(shù)據(jù)而不是分析單一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，才能得到更加清晰有用的生物學(xué)信息。值得一提的是，在細(xì)胞中有些蛋白質(zhì)的相互作用是瞬時的、不穩(wěn)定的，以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的研究方法很難捕捉到這種相互作用，而基于生物信息學(xué)的分析則能彌補(bǔ)這一不足。

  表1　蛋白質(zhì)相互作用分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站
  網(wǎng)站 資源類型 網(wǎng)址
  DIP  蛋白質(zhì)相互作用http: //dip.doe-mbi.uda.edu
  INTERACT  蛋白質(zhì)相互作用http: //bioinf.man.ac.uk/interactpr.htm
  ProNet  蛋白質(zhì)相互作用http: //pronet.doubletwist.com/
  MIPS  蛋白質(zhì)相互作用http:
  //www.mips.biochem.mpg.de/proj/yeast/tables/interactoin/index.htm
  Proteome  蛋白質(zhì)相互作用http: //www.proteome.com
  Bind  蛋白質(zhì)相互作用http: //www.binddb.org
  String  基因共定位http: //www.bork.embl-heidelberg.de/string/
  CoGs  種系發(fā)生譜http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/CoG/

  2.6　其他方法　具有相關(guān)功能或相互作用的蛋白質(zhì)他們的基因有可能受到了相同的調(diào)控，在進(jìn)化過程中也保持一定的相似性。因此，可以通過檢測 mRNA
  在特定時期的表達(dá)量，分析相關(guān)的基因產(chǎn)物是否具有相互作用關(guān)系。Stuart 等[33]研究了人、果蠅及線蟲的基因共表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)22 163 種共表達(dá)關(guān)系并且在進(jìn)化上它們也表現(xiàn)出一定的保守性。必須指出的是，有些蛋白的表達(dá)與mRNA可能不存在相互關(guān)系，mRNA 的共表達(dá)不反映蛋白間的相互作用；另外所得數(shù)據(jù)的分析也是一個繁瑣的任務(wù)。
  除了上述大規(guī)模分析蛋白質(zhì)相互作用的方法外，最近還涌現(xiàn)出一些其他的方法。多維蛋白鑒定技術(shù)(multidimensional protein identification technology, MudPIT)[34]，通過確定蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位來研究其相互作用等[35]。免疫共沉淀、GST  pull-down、 Far-western、化學(xué)交聯(lián)等目前雖不適于大規(guī)模研究，但小范圍的分析方法可對得到的結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充印證。眾多的研究方法可以從不同的角度研究蛋白質(zhì)組中的蛋白相互作用，彌補(bǔ)單個方法的不足，從而得到盡可能完整的蛋白質(zhì)相互作用圖譜。
  3　展望
  高等動物基因組研究表明，調(diào)節(jié)生物體復(fù)雜性的不是基因數(shù)量的增加，而是基于更為復(fù)雜的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間發(fā)生的相互作用。建立起這些分子之間的相互作用及調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)是后基因組時代的首要任務(wù)。這種相互作用的研究包括穩(wěn)定復(fù)合物的親和力、半衰期及瞬間的相互作用，而且這些復(fù)合物中蛋白質(zhì)的相互作用不是一成不變的，他們存在著動態(tài)變化。因此，最終的目標(biāo)是通過這些作用網(wǎng)絡(luò)，加上基因動態(tài)表達(dá)研究、蛋白質(zhì)表達(dá)量分析、蛋白定位以及基因功能分析等，最終了解細(xì)胞內(nèi)各種生理反應(yīng)的發(fā)生及調(diào)節(jié)機(jī)制，揭示生命的本質(zhì)。目前研究大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用的方法還主要是酵母雙雜交及親和層析，但研究者也發(fā)現(xiàn)，所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能很好的匹配，僅有很少的重疊。這一方面說明蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)雜及多樣性；另一方面也表明實(shí)驗(yàn)方法本身的不確定性及低重復(fù)性，對某些相互作用可能還無能為力。因此，對于大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用研究，不同方法的有機(jī)結(jié)合將給研究者提供更為豐富、準(zhǔn)確的結(jié)果。
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