1.把將被染色分析的細胞用冷PBS洗滌二次并在恰當?shù)娜旧�緩沖液（binding buffer）中以1 x 106 細胞/mL的濃度重懸。（染色緩沖液，binding buffer,中必須含有鈣離子）

2.吸取100ul的細胞(1 x 105)至試管中。（必須在室溫下進行）

3.加入適量的熒光標記的annexin V試劑和PI。（必須在室溫下進行）

4.混勻后避光室溫下孵育15分鐘。（必須在室溫下進行）

5. 孵育后加入400ul染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析。（實驗必須在一小時內(nèi)完成，否則無意義�。�
我們推薦另外制備三個質控樣本來設定流式細胞儀的熒光補償和設置十字門的范圍：
a) 沒有染色的細胞;
b) 僅用熒光標記的annexin V染色的細胞;
c) 僅用PI染色的細胞.
annexin V和PI雙陽性可以說明細胞群體中含有死亡細胞。我們推薦可以使用一個細胞系來制備以上三個對照管來作為annexin V和PI陽性染色對照。可以使用在RPMI +10% FCS + 2-4 ng/mL的TNF-a孵育2-3小時的人U-937細胞，或在培養(yǎng)液中孵育1-2小時鼠淋巴細胞作為對照細胞。

請依據(jù)以下建議來正確設置儀器補償。以下方案可以根據(jù)不同的細胞類型稍加修改。

在流式細胞儀上分析經(jīng)染色的細胞:
使用流式細胞儀正確分析annexin V-FITC和PI雙標的細胞要求儀器的熒光補償來去除兩種染料激發(fā)光之間的疊加。因為熒光補償設置與PMT的電壓直接相關，所以不同儀器之間的補償不同。我們建議在實驗開始階段分析單染的細胞來調整熒光補償去除光譜重疊。
1. 上樣未經(jīng)染色的細胞，在線性FS-SS點圖上顯示細胞并設門圈出目標細胞群體。
注意：細胞在經(jīng)培養(yǎng)后光散射信號會發(fā)生變化。要注意使用側向散射光設門來識別出這些已改變的細胞。

2.建立LogFL1-LogFL2雙參數(shù)點圖并分析以上光散射圖中設門的細胞；保證>98%的細胞處于在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中心區(qū)域。

3. 檢測annexin V-FITC單染的細胞并檢查FL1-FL2散點圖，保證在左上和右上象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在上端象限則說明有熒光滲漏；此時FL1的熒光被FL2 PMT檢測到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL1漏到FL2熒光的補償%（這可能在1-5%之間）。如果這個調節(jié)沒有有效地去除FL2的陽性信號，此時要降低FL2 PMT的電壓。

4. 檢測PI單染的細胞并檢查FL1-FL2散點圖，保證在右上和右下象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在右側象限則說明有熒光滲漏；此時PI的熒光被FL1 PMT檢測到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL2漏到FL1熒光的補償%（這可能在15-25%之間）。如果這個調節(jié)沒有有效地去除FL1的陽性信號，此時要降低FL1 PMT的電壓。

5. 如果在以上調節(jié)補償過程中更改了PMT的電壓，我們建議重復3、4步驟，確保不引起過度熒光補償。過度補償可以從陽性細胞十分貼近從標這一現(xiàn)象觀察出來。一個恰當?shù)难a償應該是單陽性細胞熒光強度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細胞的熒光強度一致。

6.因為許多未處理的細胞群體中存在一定數(shù)量的annexin V和PI雙陽性的細胞，運用annexin V試劑盒來檢測凋亡必須從處理過的細胞中扣除這些原本就存在的雙陽性細胞。

7.根據(jù)未處理細胞或對照細胞經(jīng)annexin V和PI染色后在流式細胞上分析的結果來設定十字門的位置，F(xiàn)L1和FL2的劃定方法如下：
a. 設定FL1標尺位置: 處于左下象限內(nèi)的大群細胞是annexin V染色陰性的細胞（一般這些細胞會在FL1軸方向上升至2個對數(shù)坐標值）。將垂直的FL1標尺設定在緊靠annexin V陰性群體右側0.1-0.2Log單位的地方。
b. 設定FL2標尺位置: 可以通過一定數(shù)據(jù)的雙陽性細胞來區(qū)分PI+和PI-的細胞群體。在此條件下可能會識別出兩群細胞，一是位于散點圖的右下方（ANN+/PI-）還有就是右上方（ANN+/PI+）。水平線可以置于這兩群細胞的中間。如果在分析的細胞群體中沒有PI+細胞，區(qū)分PI+細胞最好是參照雙陰性細胞群體，將水平線設在雙陰性細胞以上0.1-0.3 Log單位的地方。理想中，以上介紹的設門方法可以適用于任何細胞群體來設定十字門的位置。

8. 經(jīng)處理過的細胞此時可以用annexin V 和PI染色后在流式細胞儀上分析。那些在在陰性群體門以外的細胞可被識為annexin V或annexin V和PI陽性的細胞。


注意：建議細胞經(jīng)染色盡快分析。盡管此處沒有推薦使用經(jīng)1%甲醛固定的細胞，但它在某些實驗中可用它作為annexin V和PI雙染陽性對照使用。制備以上對照可將細胞重懸在1X的染色緩沖液和固定劑混合液中。然而這個步驟會明顯地降低annexin V和PI的染色熒光強度。