引言

朊病毒是一類會引發(fā)人類和動物腦部蛋白質(zhì)異常折疊的可傳播病原體。感染會導致腦損傷，且往往是致命的。此類神經(jīng)退行性疾病的實例包括羊瘙癢癥、瘋牛�。ㄅ：＞d狀腦病）和克雅二氏病。

以前，研究朊病毒需要進行長時間的生物測定，對受感染的動物進行長時間（1-6 個月）的研究。這種方法既費時，而且飼養(yǎng)感染動物的成本也很高。蒙大拿州漢密爾頓的落基山實驗室研究開發(fā)了一種新的朊病毒接種測定法，稱為實時震蕩誘導轉化測定法（RT-QuIC），可對受感染樣本中的朊病毒水平進行終點定量測定。與以往的方法相比，這種檢測方法速度更快，通量更高。該測定可在短短 20 小時內(nèi)完成，其靈敏度不亞于甚至高于全動物模型。

BMG LABTECH的FLUOstar Omega是唯/一具備長時間震蕩和培養(yǎng)微孔板的酶標儀，這得益于其堅固的“德國制造”結構。RT-QuIC樣本每隔15分鐘測量一次，共計20-68小時，期間交替震蕩1分鐘和靜置1分鐘。我們開發(fā)了一個軟件腳本，用于控制激活測定所需的振蕩和靜置時間。

檢測原理

RT-QuIC 檢測法用于估算朊病毒接種的相對數(shù)量。該檢測法通過測量樣本的連續(xù)稀釋，統(tǒng)計估算接種劑量（SD）。在該檢測中，極少量的傳染性朊病毒會被添加到正常的朊病毒蛋白中，從而引發(fā)或?qū)е码貌《镜鞍装l(fā)生類似疾病的錯誤折疊。測定方法是通過測量樣本的系列稀釋度并確定接種活性損失（SD50），即終點稀釋度來進行量化。

實驗步驟

在整個 20-68 小時期間，儀器設置為在 42°C 下恒溫孵育。實驗編寫了兩個測試運行協(xié)議的腳本。第一個協(xié)議設置為振蕩板一分鐘，然后靜置一分鐘；第二個協(xié)議設置為每 15 分鐘使用底部光學鏡進行一次熒光終點測量。熒光染料硫黃素 T（ThT）被用作朊病毒接種標記。將 ThT 添加到重組朊病毒蛋白中，當發(fā)生聚合反應時，ThT 就會與朊病毒蛋白結合，從而導致熒光隨著時間的推移而增加。

儀器設置

熒光終點 - 底部讀數(shù)

分析

斯皮爾曼-凱伯（Spearman-Kärber）分析法與生物測定的 50%致死劑量（LD50 ）類似，用于估算每克組織中50%的孔出現(xiàn)硫黃素T（ThT）陽性反應的播種劑量或稀釋倍數(shù)（SD50/g）。在進行 Spearman-Kärber 分析時，選擇的稀釋系列中至少有一個稀釋度的 ThT 陽性率為 100%，以及一個稀釋度的 ThT 陽性率為 0%。

結果與討論

使用軟件腳本對RT-QuIC檢測進行了20至68小時的測量，數(shù)據(jù)取自8個重復孔的相對熒光單位平均值。每個圖表僅顯示每45分鐘的數(shù)據(jù)。

FLUOstar Omega酶標儀除了線性振蕩和軌道振蕩外，還能以獨特的雙軌道振蕩模式進行振蕩。在整個測量期間，孵育溫度保持在42°C。Omega系列的高品質(zhì)設計和堅固的制造使研究人員能夠連續(xù)測量數(shù)天，而不會中斷振蕩或產(chǎn)生溫度波動。數(shù)據(jù)被不間斷地收集并輸出到BMG LABTECH的數(shù)據(jù)分析軟件（MARS）和Excel中。

圖 1 和圖 2 展示了 RT-QuIC 檢測法與倉鼠豚鼠腦勻漿（BHs）的關系。圖 1 使用的是接種后 80-85 天（DPI）的倉鼠腦勻漿樣本，而圖 2 使用的是接種后 10 天的倉鼠腦勻漿樣本。

圖 1：RT-QuIC 靈敏度：對 263K 倉鼠腦勻漿稀釋液的分析。

 
50% 接種劑量（SD50 ）是指在半數(shù)重復孔中產(chǎn)生足夠增強的 ThT 熒光的量。在本例中，用 10E-9 稀釋的刮傷病 BH 儲存液（深藍線）的 2 μl 等分試樣（接種量）就能達到近似的 SD50 。因此，Spearman-Kärber 估計的 SD50 /2μL 為 10E9.1，SD50 /g 為 10E12。該 SD50 的對數(shù)（~11）與生物測定中發(fā)現(xiàn)的 LD50 的對數(shù)（~10）非常吻合。

圖 2：對三種 263K 接種臨床前注射后 10 天的倉鼠 BH 進行 RT-QuIC 終點稀釋分析。

在此情況下，約50%的播種劑量（SD50）通過2 μl的10E−5稀釋度的瘙癢癥接種后10天263K BH原液（綠色曲線）實現(xiàn)。其SD50/2μL為10E5.5，SD50/克組織為10E8.2。

正如預期，接種后85天（DPI）樣本的SD50/克組織（10E12）高于接種后10天的樣本（10E8.2），因為有更長的發(fā)病時間。這些RT-QuIC結果與生物測定結果高度相關。數(shù)據(jù)表明，RT-QuIC檢測可視為一種比整動物生物測定更快速、更高通量的替代方法，同時也表明接種后僅十天的動物樣本即可用該方法進行檢測。

結論
多功能酶標儀

使用RT-QuIC檢測法和酶標儀可以更快、更高效地測量朊病毒接種。一些已證實可用RT-QuIC檢測的傳染性海綿狀腦病包括倉鼠和綿羊的癢病、鹿的慢性消耗性疾病、克雅氏病（CJD）和牛海綿狀腦�。˙SE）。這種檢測方法比以往的生物檢測方法更快、更靈敏。BMG LABTECH的Omega系列酶標儀功能強大且堅固耐用，能夠承受這種檢測方法所需的連續(xù)多日高速震動。

使用FLUOstar Omega的優(yōu)勢包括：

• 更快、更高通量的朊病毒接種監(jiān)測檢測方法
• 先進的酶標儀功能，包括震動和溫度控制，是檢測有效性的關鍵
• 20-68小時內(nèi)每15分鐘進行一次熒光底部讀數(shù)測量

 
有關RT-QuIC檢測的更多詳情，請查看科學講座“優(yōu)化RT-QuIC檢測的靈敏度和特異性”�？屏_拉多州立大學的Davin Henderson博士在此分析了使用RT-QuIC檢測朊病毒時需要考慮的重要因素。

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