ELISA試驗(yàn)夾心、間接及競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的操作過(guò)程
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種免疫測(cè)定方法，通常用于量化樣品中特定目標(biāo)的水平。常規(guī)用于ELISAs的樣本包括血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)通常在96孔微孔板中進(jìn)行，微孔板上涂有對(duì)相關(guān)分析物的特異性捕獲抗體。在與實(shí)驗(yàn)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌贩趸瘯r(shí)，目標(biāo)分析物被該抗體捕獲，一個(gè)共軛的檢測(cè)抗體與目標(biāo)分析物上的不同表位結(jié)合。隨后加入底物溶液，產(chǎn)生一個(gè)與分析物結(jié)合量成比例的信號(hào)。ELISA的三個(gè)主要方法是夾心法、間接法、和競(jìng)爭(zhēng)法，每種類(lèi)型的ELISA都有自己的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。
操作過(guò)程如下：
1 、夾心法：
原理：針對(duì)抗原分子上2個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。
夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原，一般的操作步驟為:
a. 將具有專(zhuān)一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的抗原，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)
c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專(zhuān)一的一次抗體，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)
d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)
e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
2、間接法
原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體。
間接法常用于檢測(cè)抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的一次抗體，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗原進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)。
c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測(cè)的一次抗體鍵結(jié)。
d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測(cè)定塑膠盤(pán)中的吸光值（OD值），以評(píng)估有色終產(chǎn)物的含量即可測(cè)量待測(cè)抗體的含量。
3、競(jìng)爭(zhēng)法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，另一組只加酶標(biāo)記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。
競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制，一般用于檢測(cè)小分子抗原，其操作步驟為：
a. 將具有專(zhuān)一性的抗體固著于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測(cè)檢體，使檢體中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)
c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)，由于塑膠孔盤(pán)上固著的抗體數(shù)量有限，因此當(dāng)檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤(pán)上抗體鍵結(jié)，即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來(lái)。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當(dāng)檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤(pán)內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
e. 當(dāng)需要偵測(cè)無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤(pán)上時(shí)，一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。
操作過(guò)程如下：
1 、夾心法：
原理：針對(duì)抗原分子上2個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。
夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原，一般的操作步驟為:
a. 將具有專(zhuān)一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的抗原，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)
c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專(zhuān)一的一次抗體，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)
d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)
e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
2、間接法
原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體。
間接法常用于檢測(cè)抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的一次抗體，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗原進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)。
c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測(cè)的一次抗體鍵結(jié)。
d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測(cè)定塑膠盤(pán)中的吸光值（OD值），以評(píng)估有色終產(chǎn)物的含量即可測(cè)量待測(cè)抗體的含量。
3、競(jìng)爭(zhēng)法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，另一組只加酶標(biāo)記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。
競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制，一般用于檢測(cè)小分子抗原，其操作步驟為：
a. 將具有專(zhuān)一性的抗體固著于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測(cè)檢體，使檢體中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)
c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結(jié)，由于塑膠孔盤(pán)上固著的抗體數(shù)量有限，因此當(dāng)檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤(pán)上抗體鍵結(jié)，即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來(lái)。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當(dāng)檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤(pán)內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
e. 當(dāng)需要偵測(cè)無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤(pán)上時(shí)，一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。
- Q熱,一種立克次體引起的人畜共患疾病檢測(cè)方法
- 小鼠鑰孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白抗體IgG/IgM(KLH-IgM/IgG)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
- ELISA試驗(yàn)夾心、間接及競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的操作過(guò)程
- 聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)體系各組份對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響
- 重組鱟試劑（rCR）成為新型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法首要選擇的原因
- 貓立克次體病，一種被長(zhǎng)期忽視的傳染病
- 猴2,5寡腺苷酸合成酶（2,5-OAS）ELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
- 猴新蝶呤（NP）ELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
- 美德聲推出豬囊尾蚴抗體檢測(cè)試劑盒和免疫IFA產(chǎn)品
- 美德聲各類(lèi)常規(guī)和稀有血型檢測(cè)試劑誠(chéng)聘專(zhuān)業(yè)代理商
- 上海撫生冬日促銷(xiāo)：分光光度法檢測(cè)試劑盒滿額折扣
- 阿克庇斯通過(guò)中檢院細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法能力驗(yàn)證
- 美德聲推出新品舒巴坦鈉-度洛巴坦鈉MIC藥敏紙條
- 熱烈慶祝西美杰榮獲LGC亞太區(qū)最佳銷(xiāo)售金獎(jiǎng)
- 樂(lè)研試劑金秋10月促銷(xiāo)活動(dòng)：消費(fèi)滿額好禮送不停
- 中檢維康推出自研新品微囊藻毒素ELISA檢測(cè)試劑盒
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com