【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：猴痘病毒熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Monkeypox virus Detection Kit(Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 50T/盒

【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測猴逗病毒，對猴逗病毒引起的感染及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗原理】
本試劑盒針對猴痘病毒基因設(shè)計一對特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有猴痘病毒基因 DNA模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【試劑盒組成】

序號	組成	50T/盒
1	猴痘 PCR反應(yīng)液	1000 μL×1管
2	猴痘 陽性對照	40 μL×1管
3	猴痘 陰性對照	40 μL×1管
4	說明書	1份

注：陰性對照為滅菌純化水，陽性對照為含猴痘靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1.從猴痘皰液、皮損部位或者患者血液獲得樣本。
2.應(yīng)避免標本間交叉污染。
3.樣品如不及時檢測，應(yīng)于-20℃至-80℃凍存。標本運輸應(yīng)于冷凍條件下進行。

【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應(yīng)液（Taq酶+UNG酶）

20μL

 
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心，按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)，剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)管蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。
 

反應(yīng)體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集猴痘病毒熒光信號
PCR 反應(yīng) 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	UNG處理	37℃：2分鐘（min）	1
	預(yù)變性	95℃：3分鐘（min）	1
	PCR擴增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號）

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果	標本檢測結(jié)果解釋
FAM
陰性（－）	標本中未檢出猴痘病毒
陽性（＋）	標本中檢測出猴痘病毒

【檢驗方法的局限性】
1.當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2.被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3.樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為10³ Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項】
1.使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2.為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；
3.各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；
4.吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；
5.試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心；
6.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
7.為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記；
8.檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9.儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。