不同應(yīng)用的正確解決方案

激光顯微解割（LMD）系統(tǒng)有許多不同類型的耗材。它們涵蓋了從基礎(chǔ)到高度專業(yè)化的廣泛應(yīng)用，使科學(xué)家能夠根據(jù)自己的研究領(lǐng)域選擇個性化的配置。

最常見的耗材是各種玻璃膜載玻片，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)蓋子以收集解剖樣本。還使用框架載玻片、帶和不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿、Ibidi 載玻片和多室培養(yǎng)載玻片。此外，徠卡 LMD 系統(tǒng)的靈活軟件設(shè)置允許使用自制或定制的標(biāo)本載體或激光微切割的收集裝置。

一般來說，徠卡顯微系統(tǒng)提供演示載玻片套件，其中包含不同類型的載玻片，以測試不同應(yīng)用的不同可用膜，以找到最適合任何應(yīng)用的膜載玻片。特別是對于熒光，測試不同的載玻片可以讓你的生活更輕松。例如，PPS 相比于 PEN 具有更少的自發(fā)熒光，但 POL 或 PET 也可能適合你的熒光染料。

 

眼見為實，用于嘗試、觀察并相信！

 

LMD樣本設(shè)備

玻璃膜載玻片

用于激光顯微切割的特殊膜安裝在玻璃載玻片上，以實現(xiàn)最高質(zhì)量的結(jié)果。覆蓋有高UV吸收膜的玻璃載玻片，特別適合冷光照射（蒸發(fā)），稱為玻璃膜載玻片。此類型的載玻片在圖 1a 的左側(cè)顯示。

膜應(yīng)用于玻璃載玻片的上表面，膜的邊緣與玻璃粘合。因此，創(chuàng)建了一個矩形區(qū)域用于安裝標(biāo)本，其中膜與玻璃基底之間有空氣。膜經(jīng)過特殊涂層處理，以確保標(biāo)本的最佳粘附。

一般來說，玻璃膜載玻片在膜輔助激光顯微切割（LMD）中具有多種應(yīng)用潛力，并配有不同應(yīng)用的各種涂層。

小心處理薄膜對于避免膜損壞至關(guān)重要。應(yīng)避免玻璃與膜之間的水分積聚，因為這可能導(dǎo)致切割物粘附在玻璃基底上。玻璃載玻片有兩種不同的膜類型：

• PPS（聚苯硫醚）

• PEN（聚乙烯萘）

圖 1a - 1c 分別展示了用于電機(jī)臺、掃描臺或 ITK LMT350 超臺的標(biāo)準(zhǔn)樣品架，放置了不同的載玻片。圖 1 顯示了一個玻璃載玻片（左）、一個框架載玻片（中）和一個 Ibidi®載玻片（右）。

圖 1a：電機(jī)臺的樣品架

圖 1b：掃描臺的樣品架

圖 1c：LMT350 超階段的標(biāo)本架

 

PEN 和 PPS 膜載玻片

（載玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用區(qū)域 19 x 41 mm）

標(biāo)準(zhǔn)載玻片具有 PEN 膜。這些膜可以用于大多數(shù)LMD應(yīng)用，除了在植物研究中使用的極高激光能量。例如，PEN 膜有兩種不同的厚度：2.0 µm 或 4 µm。4 µm 是一種特殊的發(fā)明，旨在與徠卡 LMD系統(tǒng)結(jié)合使用：該膜比 2 µm 標(biāo)準(zhǔn)膜更強(qiáng)，便于切片安裝，并在安裝過程中降低膜受損的風(fēng)險，且膜本身更重，因此更容易通過重力收集。

PEN 膜片也有經(jīng)過認(rèn)證的 RNase 和 DNase 自由版本，以保證在 DNA 和 RNA 研究中無污染的工作。與 PEN 膜片一樣，PPS 涂層膜片也可以在幾乎所有激光輔助顯微切割技術(shù)中使用。PPS 膜片的自發(fā)熒光較少，表面結(jié)構(gòu)比 PEN 膜片更光滑，但在化學(xué)處理（例如，二甲苯）方面的耐受性不如 PEN 膜片。當(dāng)使用玻璃片時，重要的是將其放入標(biāo)本架中，組織面朝下。否則，所需區(qū)域?qū)⒈磺懈�，但會掉落在膜和捕獲裝置之間的玻璃底座上，而不是被捕獲在收集容器中。

 

大型 PEN 和 PPS 載玻片

（載玻片尺寸：52 x 76 mm，LMD 可用區(qū)域 39 x 45 mm）

這些是用于特別大標(biāo)本的 PEN 或 PPS 膜玻璃載玻片，例如在神經(jīng)科學(xué)中使用的組織切片�？商峁┨厥獾臉�(biāo)本夾用于顯微解剖。大玻璃載玻片可見于圖 2a 和 2b。

圖 2a 和 2b：該標(biāo)本夾可用于大型 PEN 或 PPS 載玻片以及培養(yǎng)皿（參見圖 10a）。

 

框架載玻片

（載玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用區(qū)域 16 x 45 mm）

框架載玻片由金屬框架組成，可以覆蓋各種膜（圖 4b）。此類型載玻片可用的膜如下：

• PEN（聚對苯二甲酸萘酯）

• PPS（聚苯硫醚）

• PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯）

• POL（聚酯）

• FLUO（氟碳）

結(jié)合特殊的 150 倍干式物鏡（圖 3），它在不需要浸油的情況下提供亞細(xì)胞分辨率，框架載玻片非常適合單細(xì)胞和染色體應(yīng)用。當(dāng)使用框架載玻片時，解剖樣本直接粘附在箔片上，因此特別適合于極小樣本的解剖，例如染色體解剖。框架支撐具有凸起的表面結(jié)構(gòu)，恰好適合框架載玻片前部的凹 cavity，便于將組織切片固定到膜上。這創(chuàng)造了一個平坦的表面并支撐膜�？蚣苤�撐在某種程度上形成了膜的骨架，為在樣本準(zhǔn)備過程中將樣本施加到膜上提供了足夠的阻力和張力（圖 4）

圖 3：150 倍干式物鏡，專為與 POL 膜載玻片結(jié)合而設(shè)計，用于解剖每一個微小樣本。

然而，框架滑片可以在沒有框架支撐的情況下用于安裝組織切片。

像適當(dāng)涂層的玻璃膜滑片一樣，帶有 PPS 膜的框架滑片幾乎可以用于任何應(yīng)用。

而帶有 POL 膜的框架滑片主要用于染色體解剖（Post 等，MolEcoNotes，2006），結(jié)合 150 倍干物鏡，帶有 PET 膜的框架滑片則非常適合后續(xù)的質(zhì)譜分析技術(shù)（Drummond 等，Acta Neuropathol 2017）。與其他可用膜相比，PET 幾乎不含增塑劑，這些增塑劑可以通過 HPLC 與蛋白質(zhì)分離。這些增塑劑可能會阻塞部分質(zhì)譜圖譜，使得某些頻帶無法在被阻塞的頻譜區(qū)域中觀察到。類似的現(xiàn)象也可以在用于收集的 PCR 管中觀察到。

特殊的 FLUO 膜特別適合熒光、PH 和真正的DIC。

圖 4：帶有膜和框架支撐的金屬框架作為“骨干”。

框架載玻片也可以用作活細(xì)胞培養(yǎng)的樣本載體。因此，載玻片的矩形腔體被用作培養(yǎng)皿。建議在這種培養(yǎng)中，將載玻片放入更大的培養(yǎng)皿中，并在將細(xì)胞接種到腔體膜上后完全覆蓋培養(yǎng)基。如果使用 PEN 膜，培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不會改變，而其他類型的膜可能會由于不同膜的表面特性導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同。

可以為難以附著在膜上的樣本創(chuàng)建兩個框架滑片的夾層：簡單地將樣本夾在兩個框架的膜之間，激光足夠強(qiáng)大，可以切割這樣的夾層堆疊。液滴或涂抹制備也可以輕松應(yīng)用于使用框架滑片的激光顯微切割。

對于植物應(yīng)用以及其他硬組織如骨頭、牙齒等，推薦使用框架滑片，因為它們比玻璃滑片更能兼容高激光功率。高激光功率可能會邊緣玻璃，使得附著在其上的材料更難切割。

對于植物樣本如葉子，根本不需要膜載玻片作為載體，因為這種材料可以直接應(yīng)用于激光微切割（Hölscher，Rec Adv Polyphenol Res（2019））。

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激光微切割的采集設(shè)備

蓋子/微量離心管

在LMD解剖后，樣本在重力作用下掉入收集容器，例如標(biāo)準(zhǔn)的薄壁微離心管及其蓋子。不同滑片與蓋子的組合是激光顯微解剖中最常見的應(yīng)用之一。通常使用標(biāo)準(zhǔn)的 0.2 毫升和 0.5 毫升管，蓋子可以是空的（干燥的）或裝有合適的緩沖液或類似的適宜介質(zhì)。例如，蓋子中含有 RNase 抑制劑的溶液可以防止核酸在激光顯微解剖過程后立即分解。同樣，蛋白質(zhì)也可以通過緩沖液保持在穩(wěn)定狀態(tài)�？盏�、干燥的蓋子提供了一種良好的識別解剖樣本的方法，并且可以通過拍攝前后照片進(jìn)行輕松比較�；�本上，微解剖樣本可以轉(zhuǎn)移到任何標(biāo)準(zhǔn)蓋子上。圖 5a 和 5b 顯示了蓋子和微離心管的匹配收集器。盡管可以使用特殊的 OptiCaps（#11505169），但對于徠卡激光顯微解剖來說，這些并不是必需的。OptiCaps 具有集成的光學(xué)元件，以確保最佳的照明均勻性，并且可能是“粘性”的。然而，Leica LMD 系統(tǒng)不需要使用昂貴的非標(biāo)準(zhǔn)管蓋，因為收集過程是重力驅(qū)動的，不需要克服重力。

此外，還有 1.5 毫升的管子，配有硅膠填充的蓋子。在 LMT350 超階段的多收集器中，借助杠桿，這個填充的蓋子可以與膜上的組織接觸。這個設(shè)置有助于收集具有挑戰(zhàn)性的粘性樣本。

還有可能收集到特殊的樣本設(shè)備中，例如用于組織均質(zhì)化、蛋白質(zhì)提取和通過壓力循環(huán)技術(shù)消化的 PCT 微管（PCT, PressureBioSciences Inc.）。直接收集到這些設(shè)備中可以節(jié)省時間，因為不需要重新移液。

圖 5：用于收集蓋子和微量離心管的特殊收集裝置可以用于正常尺寸的 0.2 毫升（a）和 0.5 毫升（b）。收集器直接位于樣本下方，解剖物因重力作用直接落入管蓋中。

適用于 8 孔條、8 孔和 12 孔條蓋以及多孔載玻片（如 18 孔 Ibidi 載玻片或 LOC（實驗室芯片）載玻片的通用支架。

適用于不同收集設(shè)備的通用支架在同一載體中獨(dú)特于徠卡，并提供多種不同收集設(shè)備的選項，適用于不同的應(yīng)用。此外，通用支架可調(diào)節(jié)高度，以將所選收集器調(diào)整至靠近標(biāo)本載體，以實現(xiàn)最小的落距。

8 孔條可用于大容量應(yīng)用（例如，將活細(xì)胞收集到培養(yǎng)基中），8 孔條蓋非常適合高通量應(yīng)用。此外，通用支架適合攜帶室內(nèi)載玻片、多孔載玻片以及 LOC（實驗室芯片）設(shè)備，如 Ibidi®載玻片。所有設(shè)備均可用作激光顯微切割的收集設(shè)備。

8條LCC   

這些收集器的開發(fā)旨在提高對解剖活細(xì)胞后續(xù)檢查的樣本通量，并可以組合在一起形成 96 孔板。圖 6a 和 6b 各顯示了一個適合的持有器，帶有 8 孔條 LCC，可以組合形成孔板�？装迨沁M(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)高通量篩選的基礎(chǔ)。

使用這樣的篩選技術(shù)，可以在極短的時間內(nèi)分析大量單細(xì)胞培養(yǎng)，并在必要時進(jìn)行再培養(yǎng)。

圖 6a 和 6b：8 孔條作為解剖收集器，使細(xì)胞培養(yǎng)的高通量篩選成為可能。

 8 孔和 12 孔條蓋（用于分子生物學(xué)/PCR）   

0.2 毫升 8 孔條的蓋子可以用作激光顯微切割的收集器。在激光顯微切割后，8 孔條的蓋子可以放在 0.2 毫升 8 孔條或 96 孔 PCR 板上，直接插入 PCR 機(jī)器（可根據(jù)要求提供）。使用 8 孔條在后續(xù) PCR、定量 PCR 或其他加熱或冷卻過程中，特別適合處理大量樣本。

圖 7a 和 7b：8 孔條蓋

可調(diào)高度的 48 孔收集器（圖 8）允許同時使用六個 8 孔條，這樣在一次實驗中以最小的努力就可以輕松填充 96 孔板。

通用支架也適用于其他 LOC 設(shè)備，例如 18 孔 Ibidi®載玻片和用于活細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用的腔室載玻片（圖 9）。任何自制的收集裝置，只要具有載玻片的 x-y 尺寸，也可以與此支架結(jié)合使用。

圖 8：48 孔收集器

圖 9：帶有腔室滑片的通用支架作為收集裝置。

 

用于 LCC 模式的耗材

有多種與激光解剖、操作和選擇技術(shù)兼容的標(biāo)本載體，適用于 LCC（活細(xì)胞培養(yǎng)）。徠卡提供特定于LMD的耗材用于活細(xì)胞處理：

• 培養(yǎng)皿（帶或不帶 PEN 膜）

• Ibidi®滑片（帶或不帶 PEN膜）

這些帶有 PEN 膜的耗材可以作為解剖的標(biāo)本載體，或者，即使沒有 PEN 膜，也可以作為活細(xì)胞激光操作的標(biāo)本載體，或者作為再培養(yǎng)、克隆或下游分析的收集容器。

框滑片的矩形腔體也可以用于細(xì)胞培養(yǎng)（見上文 → 框滑片）。

此外，帶有 PEN 膜的培養(yǎng)皿以及 Ibidi® 滑片可以與常用的收集器（0.5 毫升管、0.2 毫升管、8 孔條、8 條管蓋、Ibidi 滑片、常規(guī)培養(yǎng)皿、多室培養(yǎng)滑片和 96 孔板）結(jié)合使用。

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圖 10a：一個培養(yǎng)皿和一個帶有 PEN 膜的 18 孔 ibidi 載玻片，用于活細(xì)胞培養(yǎng)。

 

培養(yǎng)皿

培養(yǎng)皿通常適合活細(xì)胞培養(yǎng)（LCC），并且有帶或不帶 PEN 膜的版本。圖 10b 顯示了已經(jīng)在圖 2a 和 2b 中說明的大型 PEN/PPS 載玻片和培養(yǎng)皿的樣品架；一個帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿已被插入，代替了大型載玻片。圖 10c 顯示了將培養(yǎng)皿用作收集器的情況。

不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿   

（Ø 50 毫米）

不帶 PEN 膜的傳統(tǒng)培養(yǎng)皿用于收集和再培養(yǎng)解剖物。不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿不能在激光顯微解剖的樣品架中使用，但可以用于活細(xì)胞操作實驗。然而，選定區(qū)域可以使用LMD激光進(jìn)行操作，并通過延時電影功能觀察長時間。

帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿   

(Ø 50 mm，適用于LMD的可用區(qū)域 Ø 30 mm)

在帶有 PEN 膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞可以在 LCC 模式下進(jìn)行解剖，并轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)皿（帶或不帶 PEN 膜）或其他合適的收集容器中。膜可以涂覆聚-L-賴氨酸或膠原蛋白，以提高粘附性和細(xì)胞生長。

Ibidi®載玻片   

（載玻片尺寸：26 x 76 mm，每個孔適用 30 µl 液體 ）

這些載玻片配備了專門設(shè)計用于激光顯微解剖活細(xì)胞的孔。每個載玻片有 18 個凹槽，底部為 PEN 膜。

Ibidi® 幻燈片可以與適用于 LCC 模式的所有收集器組合使用。

圖 11a：用于 ibidi 幻燈片的 LMT350 超級臺的幻燈片支架。

另一種無污染的選擇變體是所謂的幻燈片堆疊（圖 11b、11c），由兩個 Ibidi 幻燈片以三明治技術(shù)疊放而成。從這樣的堆疊中解剖的細(xì)胞會因重力直接落入下方固定在特殊堆疊支架中的 Ibidi 幻燈片中（圖 11b、11c）。后續(xù)的再培養(yǎng)以及提取細(xì)胞的下游分析都是可能的。

匹配的蓋子提供了進(jìn)一步的污染保護(hù)選項。

Ibidi® 幻燈片也可以與通用支架結(jié)合使用，作為 LOC 設(shè)備的收集裝置（圖 11c）。

97-96孔板  

對于需要更高通量的實驗，還有一種解決方案。96 孔標(biāo)準(zhǔn) PCR 板（半裙邊、無裙邊或全裙邊）使用戶能夠并行收集多達(dá) 96 個不同實驗的材料。這些板可以直接放入標(biāo)準(zhǔn) PCR 機(jī)器中。此外，還有用于活細(xì)胞的 96 孔板支架，例如用于克隆目的。

還有一個收集器選項，可以直接解剖到由公司Covaris®制造的特殊 96 孔板中，以進(jìn)行超聲處理。

圖 12a：與 LMT350 超級平臺一起使用的無裙邊 96 孔板作為收集器。圖 12b、12c 和 12d：無裙邊、半裙邊和活細(xì)胞 96 孔板的收集支架。

表 1：激光顯微解剖用膜滑片和培養(yǎng)皿 – 根據(jù)膜類型、膜支撐和使用的物鏡比較切割性能。激光顯微解剖性能：– 不適合；+ 滿意；++ 良好；+++ 非常好。ª這些物鏡在與最佳圖像質(zhì)量結(jié)合時，具有改進(jìn)的光學(xué)性能以傳輸 UV 光。D 代表校正環(huán)的位置。

表 2：LMD 耗材與 LMD 階段的兼容性。

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