圖 1

2.  廣泛表達(dá)的基因反應(yīng)模式的分析
為了研究早期信號(hào)通路中基因的反應(yīng)模式，我們根據(jù)每個(gè)細(xì)胞簇中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，將4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的1868個(gè)基因分為6個(gè)基因類別（圖2a和補(bǔ)充數(shù)據(jù)3）。共有838個(gè)不能準(zhǔn)確地分配到這六個(gè)類別的基因被丟棄（方法）。從第2類到第6類的5個(gè)基因類別在所有細(xì)胞簇中都表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式（圖2b）。接下來，我們研究了每種細(xì)胞類型對(duì)NFs的反應(yīng)。通過整合四個(gè)snRNA數(shù)據(jù)集從不同的時(shí)間點(diǎn)，與上述結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組在0.5 hpt顯示最低的相似性與其他時(shí)間點(diǎn)，表明根經(jīng)歷了廣泛的轉(zhuǎn)錄組重編程迅速NFs刺激和逐步恢復(fù)后6hpt（圖. 2c和補(bǔ)充圖.6）。之前的全根研究21也揭示了根瘤菌接種后1h的瞬時(shí)重編程，我們的結(jié)果表明，瞬時(shí)重編程在表皮和皮質(zhì)細(xì)胞中最為明顯，突出了這兩種細(xì)胞類型在NFs感知中的重要作用（補(bǔ)充圖6）。我們還發(fā)現(xiàn)，在0.5 hpt時(shí)的時(shí)間點(diǎn)特異性上調(diào)基因數(shù)量最高，證實(shí)了0.5 hpt在早期反應(yīng)中的唯一性（圖2d和補(bǔ)充數(shù)據(jù)4）。我們通過添加一個(gè)新的生物復(fù)制來驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)，并通過使用完全基于組合的方法（方法）分析兩個(gè)重復(fù)的數(shù)據(jù)集，獲得了高度一致的結(jié)果(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4。值得注意的是，對(duì)這些誘導(dǎo)基因的基因功能富集分析顯示，在0.5 hpt時(shí)，幾乎所有分化的細(xì)胞類型（除中柱亞型簇8外）都誘導(dǎo)了植物防御相關(guān)通路，特別是在表皮和皮質(zhì)中。在6 hpt時(shí)，這些細(xì)胞在表皮中仍然活躍(圖2e和補(bǔ)充圖7–9)。
 

圖 2

3. 表皮細(xì)胞的一種亞型是SNF所必需的
通過重新聚類，表皮可進(jìn)一步分為兩種亞細(xì)胞類型（亞簇1-0和1-1亞簇）（圖3a)。在所有四個(gè)樣本中都發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)子簇，這表明在應(yīng)用NFs之前，差異導(dǎo)致了兩個(gè)子簇的差異（圖3b）。此外，我們的列表中 1-1specifically 表達(dá)的基因 GH9CI的 GUS 信號(hào)主要標(biāo)記成熟區(qū)的根毛和表皮細(xì)胞(圖3c)，這與擬南芥根毛和表皮中根毛標(biāo)記基因 AtGH9Cl的表達(dá)模式一致。與根毛在根瘤菌感染初期的重要作用一致，我們發(fā)現(xiàn)已知SNF 基因在子集群 1-1中的比例顯著高于 1-0(圖 3d、e和補(bǔ)充數(shù)據(jù)2)。此外，與叢枝菌根共生(AMS)相關(guān)的GO功能也被富集(圖3f)。
 

圖 3

4. MtFER與LYK3共表達(dá)
為了進(jìn)一步探索它們的功能，我們?cè)?.5hpt時(shí)提取了表皮和皮質(zhì)細(xì)胞，以構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖4a和補(bǔ)充數(shù)據(jù)7)。結(jié)瘤所需的乙烯響應(yīng)因子2（ERN2），PUB1和LYK3圖4a、c）MtFER（Medtr7g073660），擬南芥鐵藻的明顯同源物（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6），也在LYK3的模塊中被發(fā)現(xiàn)。LYK3可以磷酸化PUB1，并在早期反應(yīng)中調(diào)節(jié)結(jié)瘤。此外，我們發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因的表達(dá)水平均在0.5 hpt時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，這表明MtFER可能與PUB1和LYK3發(fā)生相互作用（圖4d）。
 

圖 4

5. MtFER的表達(dá)模式與LYK3相似
我們注意到pMtFER：GUS在根尖高表達(dá)，而pLYK3：：GUS在該區(qū)域弱表達(dá)（圖5a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7）。有趣的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，在酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)中，MtFER蛋白可以與LYK3相互作用（圖5b）。當(dāng)LYK3-FLAG和MtFER-HA在本煙草葉片中共表達(dá)時(shí)，我們通過共免疫沉淀（Co-IP）進(jìn)一步證實(shí)了相互作用（圖5c）。最后，我們?cè)隗w外激酶實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LYK3可以磷酸化MtFER（圖5d）。我們的研究結(jié)果表明，根瘤菌共生過程中對(duì)MtFER的需求可能與其與LYK3的相互作用有關(guān)。
 

圖 5

參考文獻(xiàn)：
[1]Liu Z , Yang J ,Long, YanpingZhang, ChiWang, DapengZhang, XiaoweiDong, WentaoZhao, LiLiu, ChengwuZhai, JixianWang, Ertao.Single-nucleus transcriptomes reveal spatiotemporal symbiotic perception and early response in Medicago[J].Nature Plants, 2023, 9(10):1734.