02 CFU
CFU形成是細(xì)胞系增殖或自我更新能力的良好指標(biāo)。在這項研究中，我們計算了P2和P5的hDPSCs形成的細(xì)胞集落數(shù)。分析表明，在SCM和AMMS培養(yǎng)的hDPSCs之間，以及在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P2和P5的hDPSCs之間，CFU形成率沒有顯著差異。在SCM中培養(yǎng)的細(xì)胞形成的集落更立體和聚集，而在AMMS中培養(yǎng)的細(xì)胞形成的集落扁平、松散和更大。這可能表明在AMMS培養(yǎng)的細(xì)胞具有更高的增殖能力。

03 內(nèi)皮祖細(xì)胞的免疫表型
根據(jù)ISCT對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定義，我們用流式細(xì)胞儀檢測了P2和P5的hDPSCs的免疫表型，包括CD73、CD90、CD105、CD45、CD14、CD19、CD34、HLA-DR，>95%，幾乎不表達(dá)CD45、CD14、CD19、CD34和HLA-DR<2%。統(tǒng)計分析顯示，在SCM和AMMS中培養(yǎng)的細(xì)胞之間的表達(dá)百分比沒有顯著差異(所有p> 0.05)，以及在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P2和P5的細(xì)胞之間沒有差異。
 

SCM和AMMS培養(yǎng)的hDPSCs免疫表型標(biāo)志物的表達(dá)，陰性對照(綠色)，人類牙髓干細(xì)胞；
SCM:含血清培養(yǎng)基；  AMMS:無血清/異種培養(yǎng)基（同立海源生物）

04 干性和衰老分析
干性保持是評估細(xì)胞質(zhì)量和細(xì)胞制造過程適用性的一個很好的特征。在這里通過實時PCR檢測多潛能標(biāo)記基因的表達(dá)NANOG、OCT4和SOX2。P2和P5的細(xì)胞在SCM和AMMS培養(yǎng)的細(xì)胞中，這三種基因的表達(dá)都沒有表現(xiàn)出任何差異。然而培養(yǎng)至P5時，確實導(dǎo)致了SCM中SOX2的表達(dá)(p=0.002)。這些結(jié)果可能反映了當(dāng)細(xì)胞在AMMS培養(yǎng)時，干細(xì)胞保持得稍好。通過基于SA-β-gal活性的染色來檢測擴(kuò)增期間的細(xì)胞衰老，檢測表明衰老細(xì)胞的比例很低(SCM:9.92±2.54%；AMMS:10.03±2.81%)。
 

分析干細(xì)胞相關(guān)基因(NANOG，OCT4，SOX2)的表達(dá)和傳代培養(yǎng)過程中的細(xì)胞衰老

(a) 在P2和P5的SCM和AMMS中培養(yǎng)的細(xì)胞之間的相對mRNA表達(dá)比較(在P2的SCM中培養(yǎng)的不同基因的表達(dá)作為對照)；
(b) SA-β-GAL染色(藍(lán)色細(xì)胞表示衰老)；
(c) 當(dāng)在SCM中培養(yǎng)時SA-β-gal陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率與P5時AMMS的比較(p=0.97)(比例尺=200微米)；

SCM:含血清培養(yǎng)基；  AMMS:無血清/異種培養(yǎng)基（同立海源生物）

05 細(xì)胞因子分泌
采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測P5細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，包括HGF、FGF2、BDNF、GDNF、IL-6、IL-10、PGE2和TGFβ1。結(jié)果顯示，與SCM培養(yǎng)的細(xì)胞相比，AMMS培養(yǎng)的細(xì)胞HGF的表達(dá)較高，而PGE2和TGFβ1的表達(dá)較低。這些數(shù)據(jù)表明，與SCM中分離的hDPSCs相比，在AMMS分離的hDPSCs表現(xiàn)出更高的增殖和自我更新能力。
 

06 體外三系分化潛能
許多研究證明了hDPSCs向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化能力.茜素紅染色顯示，在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hDPSCs在誘導(dǎo)后顯示出大量的礦物質(zhì)沉積，但是成骨標(biāo)記物(ALP和RUNX)是在AMMS擴(kuò)大的hDPSCs中檢測到的。與先前的研究一致，在SCM中培養(yǎng)的hDPSCs顯示出有限的成脂分化潛能，但在AMMS擴(kuò)增的hDPSCs表現(xiàn)出更明顯的脂滴染色和更高的標(biāo)記基因(LPL和PPARγ)成脂誘導(dǎo)下的表達(dá)�？偟膩碚f，在AMMS擴(kuò)增的hDPSCs比在SCM中擴(kuò)增的顯示出更高的成骨和成脂潛能。
 

P5時在SCM和AMMS中培養(yǎng)的hDPSCs的三系分化潛能

(a)分別用茜素紅、油紅O和阿利新藍(lán)染色顯示hDPSCs的成骨、成脂和成軟骨能力；

(b)成骨相關(guān)基因(ALP，RUNX2)的相對mRNA表達(dá)水平；

(c)成脂相關(guān)基因(LPL，PPARγ)的相對mRNA表達(dá)水平；

(d)軟骨形成相關(guān)基因(ACAN，SOX9)的相對mRNA表達(dá)水平(比例尺=200微米，*p<0.05)；

人類牙髓干細(xì)胞；

SCM:含血清培養(yǎng)基；  AMMS:無血清/異種培養(yǎng)基（同立海源生物）

總結(jié)
所以綜合來看，相比SCM，AMMS更有優(yōu)勢，并且在現(xiàn)行的管理體系下，無血清培養(yǎng)基替換含血清培養(yǎng)基是大勢所趨，不僅提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批次之間差異的影響，減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險、血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性、血清中蛋白對某些生物測定的干擾，更有利于對實驗結(jié)果的分析等等。

同立海源AMMS^® MSC試劑盒套裝2.0，適用于原代及凍存間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增，成分明確，穩(wěn)定性高，操作簡單，無需添加谷氨酰胺，無血清，無異源成分，擴(kuò)增效率高，表型穩(wěn)定。產(chǎn)品已通過美國FDA的DMF備案(035589)，干細(xì)胞藥物臨床實驗最佳選擇。
 

參考文獻(xiàn)：
1. JUAN LI, XUEWEI LV, TINGTING GEC, JIAMAN SHI,GIDEON VERWOERD,HAIYAN LIN and  YUANSONG YU, Improved Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) Isolated and Expanded in a GMP Compliant and Xenogeneic Serum-free Medium.