1986年，Orthoclone OKT3^®的獲批標(biāo)志著單克隆抗體 (monoclonal antibody, mAb) 首次應(yīng)用于臨床。自 Orthoclone OKT3^®獲批以來(lái)的30多年里，70多種抗體被批準(zhǔn)用于治療或診斷，占整個(gè)生物治療市場(chǎng)份額50%以上。這類治療藥物之所以取得成功，得益于相較小分子化合物的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，如較高的靶向特異性和極低的基因毒性。然而，抗體的臨床前開發(fā)也面臨著某些特有難題。抗體具有高度的物種特異性，不僅表現(xiàn)在與靶標(biāo)結(jié)合的可變區(qū)，也表現(xiàn)在延長(zhǎng)抗體半衰期所需的Fc區(qū)。

藥物開發(fā)人員常利用細(xì)胞生成千上萬(wàn)種抗體，然后從中選擇與靶標(biāo)親和力最強(qiáng)的抗體 (Singh et al., 2018)。根據(jù)相互作用的位點(diǎn)，抗體可阻斷或激活目標(biāo)蛋白，從而促進(jìn)目標(biāo)蛋白的清除，或者誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)目標(biāo)蛋白細(xì)胞的免疫反應(yīng)。此外，抗體還可以與藥物或毒素偶聯(lián)，增加特定部位的局部藥物濃度。與其他在血清中半衰期僅有數(shù)小時(shí)的蛋白相比，抗體在血液循環(huán)中十分穩(wěn)定。免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 是治療開發(fā)過(guò)程中最常使用的抗體類型，其半衰期約為21天。 IgG半衰期較長(zhǎng)是因?yàn)?IgG 與新生兒 Fc 受體 (Fc receptor, FcRn；又稱Fc gamma receptor and transporter, FCGRT) 之間存在相互作用。

本文中，我們將討論抗體類治療藥物研發(fā)中的一些難題，包括評(píng)估藥代動(dòng)力學(xué)特征、選擇有療效的候選抗體分子以及確定適合的給藥劑量。
 
通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估改善臨床相關(guān)性
 
單克隆抗體，特別是IgG類抗體，其半衰期顯著長(zhǎng)于其他分子，同時(shí)具有較高的靶向特異性。這兩項(xiàng)特征使IgG mAb 成為研發(fā)治療藥物的理想之選。
 
延長(zhǎng)治療性抗體的半衰期能夠提高療效、減少患者的治療次數(shù)，從而降低患者的治療和用藥成本。在發(fā)現(xiàn)具有所需特異性的治療性抗體后，研發(fā)人員通常會(huì)對(duì)潛在的候選抗體進(jìn)行優(yōu)化，提高Fc與FcRn的親和力。由于缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)工具來(lái)預(yù)測(cè)患者體內(nèi)抗體的半衰期，這一過(guò)程往往困難重重。
 
使用小鼠模型預(yù)測(cè)候選治療性抗體藥代動(dòng)力學(xué)(PK)數(shù)據(jù)的主要難點(diǎn)在于，不同物種對(duì)免疫球蛋白的處理方式不同。在哺乳動(dòng)物中，大多數(shù)血液循環(huán)中的蛋白質(zhì)會(huì)被內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞持續(xù)攝取，并通過(guò)內(nèi)體進(jìn)入溶酶體進(jìn)行降解。內(nèi)體pH降低，從而為蛋白質(zhì)進(jìn)入溶酶體降解做準(zhǔn)備。在該過(guò)程中，IgG蛋白會(huì)通過(guò)其Fc片段與跨膜受體FcRn相結(jié)合，從而避免降解。之后，F(xiàn)cRn-IgG復(fù)合物會(huì)重新定位于質(zhì)膜，并將IgG釋放回血清中。因此，相較于其他蛋白質(zhì)以及其他抗體類型抗體(IgA 、 IgE 和 IgM)， IgG的半衰期顯著延長(zhǎng)。但是，人源IgG與人源或鼠源FcRn的相對(duì)親和力差異極大，這使得野生型小鼠很難用作預(yù)測(cè)人類患者PK的模型。
 
抗體半衰期可能受到多種因素的影響，包括pH值、FcRn結(jié)合域或可變區(qū)的修飾、各種接頭(linker)的使用以及有效荷載的類型(如抗體-藥物偶聯(lián)物)。因此，一組不同的治療抗體需要進(jìn)行PK表征，以便選出最理想的候選抗體分子。
 
人源IgG-FcRn相互作用的親和力可以使用細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)或表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance）等經(jīng)濟(jì)有效的體外方法進(jìn)行快速定量。最終需要獲得半衰期、清除率 (clearance, CL) 和曲線下面積 (area-under-the-curve, AUC) 等臨床相關(guān)PK值。通常情況下，體內(nèi)PK測(cè)定方法為，通過(guò)靜脈將候選抗體注射入動(dòng)物模型中，隨后幾天內(nèi)測(cè)定血清中的抗體濃度。最后，將清除率和半衰期值轉(zhuǎn)換為患者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)估算值。
 
直到數(shù)年之前，現(xiàn)有動(dòng)物模型在準(zhǔn)確測(cè)定人源抗體的PK方面仍存在很大的局限性。例如，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物模型相對(duì)廉價(jià)，且便于進(jìn)行治療性候選IgG的半衰期檢測(cè)。但是，使用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物模型存在缺點(diǎn)，即小鼠源和大鼠源FcRn在與人源IgG結(jié)合時(shí)，其親和力與人源FcRn存在較大差異，這導(dǎo)致獲得的半衰期數(shù)據(jù)并不準(zhǔn)確 (Ober et al., 2001)。因此，當(dāng)使用野生型小鼠時(shí)，半衰期結(jié)果可能具有高度變異性，并且無(wú)法獲得臨床相關(guān)數(shù)據(jù)。出于Fc-FcRn結(jié)合的物種相似性考慮，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可以合理準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)人源抗體在患者體內(nèi)的PK；但是由于倫理和成本方面的原因，在藥物開發(fā)的早期階段將其用于篩選并不可行。
 
改善臨床相關(guān)性、降低對(duì)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物依賴性的潛在解決方案之一為——使用經(jīng)過(guò)基因修飾的小鼠模型。為了解決因缺乏臨床前模型而難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)治療藥物半衰期的問(wèn)題，杰克森實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家Derry Roopenian博士開發(fā)了一種特殊小鼠模型。該小鼠缺乏內(nèi)源性小鼠FcRn基因，并攜帶人的FCGRT序列，因此僅表達(dá)人源FcRn蛋白 (Proetzel and Roopenian, 2014)。人源化FcRn小鼠模型B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/ DcrJ (014565)（又稱“Tg32”），和B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(CAG-FCGRT)276Dcr/ DcrJ (004919)（又稱“Tg276”）可用于預(yù)測(cè) IgG抗體在人體內(nèi)的PK，其準(zhǔn)確性可媲美非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。此外，小鼠之間的變異性極小，因此每項(xiàng)研究所需的動(dòng)物數(shù)量也較少。
 
就PK結(jié)果而言，已獲得臨床批準(zhǔn)的治療性抗體在人源化FcRn Tg32小鼠中的結(jié)果與臨床患者觀察到數(shù)據(jù)顯著相關(guān)——這可能是因?yàn)門g(FCGRT)32Dcr由人啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控表達(dá)。當(dāng)對(duì)于多種人源IgG治療藥物的PK特征進(jìn)行大規(guī)模比較時(shí)，這些藥物在人類患者和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物以及Tg32小鼠中的半衰期和清除率范圍非常接近。盡管各藥物在Tg32小鼠中的半衰期較短，但從最短到最長(zhǎng)的半衰期順序與臨床患者觀察到的數(shù)據(jù)高度相關(guān)，因此能夠通過(guò)異速放大法將Tg32小鼠中的藥物清除率和半衰期轉(zhuǎn)換為人類患者中的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
 
 
一種避免出現(xiàn)抗藥抗體的分析方案
 
值得注意的是，許多人源化FcRn轉(zhuǎn)基因模型具有正常的小鼠免疫系統(tǒng)。因此，研究中的人源抗體有可能引發(fā)抗藥抗體 (antidrug antibody, ADA) 反應(yīng)。出現(xiàn)ADA后（通常為給藥后5 - 10天），人源IgG的半衰期將喪失或嚴(yán)重縮短，致使PK數(shù)據(jù)難以解釋。如果僅有少數(shù)小鼠出現(xiàn)ADA，則可能需要舍棄受影響動(dòng)物的數(shù)據(jù)。
 
在某些情況下，實(shí)驗(yàn)組的大多數(shù)動(dòng)物都出現(xiàn)ADA反應(yīng)，這會(huì)影響PK評(píng)估。如果擔(dān)心候選治療藥物可能導(dǎo)致ADA，或是需要徹底避免ADA發(fā)生，可以考慮選擇免疫缺陷背景的人源化FcRn小鼠模型。杰克森實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家已將Prkdc^scid基因回交到Tg32小鼠中，使其具有免疫缺陷（018441；B6.Cg-Fcgrt_tm1Dcr Prkdc^scid Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ）。由于產(chǎn)生成熟B細(xì)胞需要Prkdc基因， scid突變小鼠無(wú)法產(chǎn)生抗體，從而排除了產(chǎn)生ADA的可能性 (Myzithras et al., 2017)。值得注意的是，由于內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞是FcRn 介導(dǎo)再循環(huán)的主要場(chǎng)所，而scid突變并不會(huì)影響上述細(xì)胞的數(shù)量和功能，因此在這些模型中，免疫缺陷并不會(huì)影響PK相關(guān)數(shù)據(jù)。
 
為您的候選藥物選擇適合的給藥劑量
 
抗體的使用已經(jīng)解決了有關(guān)藥物毒性的諸多問(wèn)題。抗體的固有特異性使脫靶效應(yīng)的可能性顯著降低，并且抗體也不可能轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物�？贵w介導(dǎo)的毒性主要源自非治療部位的抗原表達(dá)，以及免疫調(diào)節(jié)抗體介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)過(guò)度活化 (Brennen et al., 2010)。對(duì)于這兩種情況，候選治療藥物的適當(dāng)劑量能夠有助于預(yù)防和限制不良反應(yīng)。然而，如果無(wú)法獲得用于預(yù)測(cè)人體中抗體PK的準(zhǔn)確的臨床前數(shù)據(jù)，在設(shè)計(jì)臨床研究時(shí)設(shè)定治療劑量就十分困難。在許多情況下，需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行劑量遞增研究，但這樣會(huì)降低治療效果，或增加出現(xiàn)副作用的可能性。
 
可使用杰克森實(shí)驗(yàn)室人源化FcRn Tg32小鼠對(duì)抗體PK參數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確的臨床前評(píng)估，該小鼠具有人源FCGRT生理性表達(dá)模式 (Latvala et al., 2017)。在已有治療靶標(biāo)的情況下，Tg32小鼠還可以用于評(píng)估藥效學(xué)研究中的劑量譜，從而縮小疾病治療模型中的最佳劑量。這些數(shù)據(jù)可用于支持治療性抗體臨床給藥劑量的相關(guān)決策。利用通過(guò)Tg32小鼠獲得的PK參數(shù)及預(yù)測(cè)性異速放大獲得的人類PK參數(shù) (Betts et al., 2018)，臨床醫(yī)生可以估算達(dá)到預(yù)期治療效果所需要的最佳劑量范圍，從而減少在臨床試驗(yàn)期間使用具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的劑量遞增研究。
 
白蛋白載體的藥代動(dòng)力學(xué)分析
 
白蛋白是僅有的另一種能夠在酸性pH條件下與FcRn上獨(dú)特位點(diǎn)相結(jié)合的天然配體。與IgG類似，白蛋白可避免被溶酶體降解，其在人體內(nèi)的半衰期為21天。因此，可以將短效治療藥物與白蛋白偶聯(lián)，以延長(zhǎng)治療藥物的半衰期并增加暴露量，同時(shí)降低給藥頻率。
 
使用人源化FcRn Tg32小鼠 (014565) 進(jìn)行人白蛋白臨床前PK建模的挑戰(zhàn)依舊是物種間親和力的差異。小鼠源IgG對(duì)人源FcRn沒(méi)有明顯的親和力，但小鼠白蛋白對(duì)人源FcRn 的親和力卻遠(yuǎn)高于人白蛋白。由于小鼠白蛋白對(duì)FcRn的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致在Tg32小鼠中人白蛋白的半衰期縮短。為使Tg32小鼠模型能夠用于人白蛋白PK分析，杰克森實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，靶向小鼠白蛋白基因構(gòu)建了B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Alb ^em12MVW Fcgrt^tm1Dcr/MvwJ (025201) 小鼠，又稱“Tg32 Alb KO”小鼠。Tg32 Alb KO 小鼠中，人白蛋白的半衰期為14 - 16天，這與人體中半衰期接近。此外，與利用Fc變體改善候選治療性IgG的PK類似，白蛋白變體也可以用于改善FcRn親和力和PK。為了避免白蛋白-藥物偶聯(lián)或白蛋白親和力變體導(dǎo)致ADA，科學(xué)家將Prkdc^scid基因移至Tg32 Alb KO小鼠，構(gòu)建出具有免疫缺陷的小鼠模型（031644；B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Alb ^em12MVW Fcgrt^tm1Dcr Prkdc^scid/J），它可用于白蛋白PK分析。
 
hFcRn 模型開發(fā)前景
 
NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjt/SzJ (005557) 又稱NSG小鼠。經(jīng)CD34+細(xì)胞人源化以提供人源免疫應(yīng)答，并將患者源性異種移植物 (Patient Derived Xenografts, PDX) 植入NSG小鼠，已成為開發(fā)用于治療癌癥的免疫治療抗體所需的重要模型。NSG小鼠攜帶小鼠源FcRn，因此使用該小鼠模型評(píng)估人源IgG治療藥物時(shí)，雖能較好地反映療效，但無(wú)法理想地反映人類PK�，F(xiàn)已通過(guò)增加Tg32對(duì)NSG小鼠進(jìn)行改善，使其FcRn“人源化”，即 NOD.Cg-Fcgrt^tm1Dcr Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjt Tg(FCGRT)32Dcr/J (028615)，又稱“NSG Tg32”。但是，由于NSG和NSG Tg32小鼠表達(dá)特有的高親和力Fcγ受體（FcγRI 和 FcγRIV），人源IgG在這兩種小鼠體內(nèi)的半衰期仍較短。在與人源IgG的結(jié)合能力方面，F(xiàn)cγ受體遠(yuǎn)超F(xiàn)cRn，它就像水槽一樣將人源IgG從循環(huán)中清除 (Li et al., 2019)。作為改善方案，JAX也正在積極地對(duì)NSG Tg32小鼠進(jìn)行基因工程改造，使其不表達(dá)Fcγ受體。
 
 
加速前沿療法進(jìn)入臨床轉(zhuǎn)化
 
抗體藥代動(dòng)力學(xué)的早期臨床前評(píng)估結(jié)果會(huì)影響治療藥物開發(fā)的多個(gè)方面。人源化FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠模型的引入，為研究人員在藥物開發(fā)早期選擇具有最佳PK的抗體提供了新工具。反之，通過(guò)將資源集中于最有潛力的候選治療藥物上，藥物開發(fā)人員可以提高其產(chǎn)品開發(fā)成功率，并更快地將有效的抗體療法推向臨床應(yīng)用。
 
杰克森實(shí)驗(yàn)室的hFcRn小鼠模型平臺(tái)能夠模擬人源IgG特定的生理學(xué)特征，并為藥物開發(fā)早期階段中評(píng)估候選治療性抗體的PK提供了理想的模型平臺(tái)。此外，這些模型為預(yù)測(cè)候選治療性抗體和Fc變體在患者中的PK數(shù)據(jù)提供了一種可靠有效的方法，并且可以節(jié)省時(shí)間和成本。
 
杰克森實(shí)驗(yàn)室治療性抗體評(píng)估服務(wù)可提供這種獨(dú)特的hFcRn小鼠模型相關(guān)抗體評(píng)估服務(wù)研究人員也曾直接參與上述模型的開發(fā)和早期表征工作。杰克森實(shí)驗(yàn)室的服務(wù)產(chǎn)品憑借豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，能夠從研究設(shè)計(jì)到實(shí)施給予全方位的優(yōu)質(zhì)指導(dǎo)，獲得快速且經(jīng)濟(jì)有效的IgG治療藥物評(píng)估，幫助客戶獲得與醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化相關(guān)的準(zhǔn)確的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，從而確定最有可能應(yīng)用于臨床的治療性分子。
 
 
推薦資源
 
治療性抗體評(píng)估服務(wù)
借助杰克森實(shí)驗(yàn)室服務(wù)揭示抗體特性
快訊：改善抗體半衰期測(cè)量
借助杰克森實(shí)驗(yàn)室FcRn小鼠模型揭示抗體半衰期和穩(wěn)定性