作為免疫系統(tǒng)的第一反應(yīng)者，自然殺傷細(xì)胞(NK)對于快速檢測和消除癌癥至關(guān)重要。它們在沒有事先致敏的情況下殺死癌細(xì)胞的能力使它們成為理想的免疫治療的候選者。當(dāng)激活受體(如CD16)與單克隆抗體結(jié)合在靶細(xì)胞上時，NK細(xì)胞會誘導(dǎo)一種被稱為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。將過繼NK細(xì)胞與單克隆抗體結(jié)合輸注是治療癌癥的一種有潛力的策略。

達(dá)雷木單抗(Daratumumab，DARA)是一種與CD38結(jié)合的單抗，在治療多發(fā)性骨髓瘤方面顯示具臨床療效，使其成為增強(qiáng)NK細(xì)胞輸注的一個有吸引力的候選藥物。然而，由于循環(huán)NK細(xì)胞表達(dá)高水平的CD38, DARA可導(dǎo)致ADCC依賴的NK自相殘殺，限制了這種組合療法的療效。結(jié)合DARA和過繼轉(zhuǎn)移CD38基因敲除的NK細(xì)胞具有最大化ADCC并阻止DARA誘導(dǎo)的自相殘殺的潛力，增強(qiáng)NK細(xì)胞持久性。為了進(jìn)一步增強(qiáng)它們的功效，NK細(xì)胞可以被改造成表達(dá)高親和CD16 (CD16-158V)受體，該受體已被證明可以促進(jìn)ADCC，從而改善臨床結(jié)果。

在這里，我們展示了MaxCyte®如何在NK細(xì)胞中啟用多重基因工程。雙編輯NK細(xì)胞改善了DARA治療，增強(qiáng)了體外和體內(nèi)的抗腫瘤反應(yīng)。MaxCyte電穿孔技術(shù)提供了包括高效率、低毒和臨床可擴(kuò)展性在內(nèi)的顯著優(yōu)勢，使一種有效的癌癥治療方法得以快速發(fā)展。
 
來自Childs實(shí)驗(yàn)室的這項(xiàng)令人興奮的研究使用了互補(bǔ)的基因工程策略來產(chǎn)生具有增強(qiáng)ADCC效力的NK細(xì)胞，且在DARA存在下不自相殘殺。這些實(shí)驗(yàn)表明，MaxCyte電穿孔對細(xì)胞活力和功能的影響很小，是一個安全的平臺，可以幫助開發(fā)基于細(xì)胞的癌癥治療方法。
 
 
方法

•  從健康供體外周血灰黃層細(xì)胞中獲取NK細(xì)胞。
• 體外擴(kuò)增分離NK細(xì)胞一周。NK細(xì)胞與輻照的Epstein–Barr病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞和IL-2共培養(yǎng)。
• 使用MaxCyte ATx®和NK-04電穿孔方案將預(yù)絡(luò)合的Cas9和靶向CD38的gRNA遞送到擴(kuò)增的NK細(xì)胞。CD16-158V的敲入(KI)通過兩種不同的途徑完成:電穿孔或AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)。
• CD16的瞬時表達(dá)ATx®用于傳遞CD16-158V mRNA在第一次電穿孔7天后轉(zhuǎn)染到CD38KONK細(xì)胞中，產(chǎn)生瞬時雙編輯NK細(xì)胞。
• 穩(wěn)定CD16KI重組腺相關(guān)病毒(rAAV6)，含有編碼CD16-158V基因的HDR模板，在初始電穿孔30分鐘后，將N端FLAG標(biāo)簽添加到CD38KONK細(xì)胞中。轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定CD16-158V在CD38位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因整合.
• 分離工程細(xì)胞，采用PCR和流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行鑒定。分離的NK細(xì)胞的功能通過體外殺傷實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)多發(fā)性骨髓瘤模型測定。

結(jié)果
高效基因敲除
 
　　MaxCyte®能夠在92%的擴(kuò)增NK細(xì)胞中有效敲除CD38(圖1A)。電穿孔對細(xì)胞的影響較小，因?yàn)檗D(zhuǎn)染后幾天細(xì)胞存活率仍然很高(圖1B)。
   
CD38KO NK細(xì)胞的表征
基因工程沒有改變NK細(xì)胞的增殖或功能特征。未編輯NK細(xì)胞和CD38KO NK細(xì)胞具有相似的體外擴(kuò)增率(圖2A)，并且電穿孔后NK表面受體的表達(dá)沒有顯著改變(圖2B)。在靶細(xì)胞存在的情況下，通過測量溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(CD107a)在NK細(xì)胞上的表達(dá)來確定脫粒，并且在CD38KO和CD38WT細(xì)胞中相似(圖2C)。此外，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性在未編輯和工程N(yùn)K細(xì)胞之間具有可比性，這是通過靶細(xì)胞存在下細(xì)胞內(nèi)IFN-γ(圖2D)和TNF-α(圖2E)的產(chǎn)生來確定的。
 
電穿孔后NK細(xì)胞的增殖和功能特征保持不變。A)電穿孔后14天CD38KO和CD38WTNK細(xì)胞擴(kuò)增。B-E)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD38KO和CD38WTNK細(xì)胞與靶細(xì)胞(K562或Raji細(xì)胞)共培養(yǎng)后標(biāo)志物的表達(dá)。以利妥昔單抗(RITUX)處理的Raji細(xì)胞為陽性對照。B)CD38KO和CD38WTNK細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)。C)通過CD107a表達(dá)測定脫粒。D-E)NK細(xì)胞毒性通過細(xì)胞內(nèi)INF-γ和TNF-α的表達(dá)測定。
 
激活CD38KONK細(xì)胞
為了確定加入CD16-158V是否可以增強(qiáng)CD38KONK細(xì)胞的效力，我們使用電穿孔將CD16-158V mRNA傳遞到工程細(xì)胞中。CD38KONK細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD16-158V mRNA與經(jīng)DARA處理的CD38+NCI-H929骨髓瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時，顯示出更好的細(xì)胞裂解能力(圖3)。MaxCyte電穿孔法證實(shí)了CD38KONK細(xì)胞表達(dá)CD16-158V后可進(jìn)一步增強(qiáng)效力。
 
　　電穿孔后一天不同的效靶比(E:T)，CD38KONK細(xì)胞表達(dá)CD16-158V (CD38KO+EP)或不表達(dá)CD16-158V存在下，DARA處理的NCI-H929細(xì)胞的裂解情況。
 
多重基因工程技術(shù)
 通過電穿孔和AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的多重基因工程。使用CRISPR-Cas9 RNP電穿孔破壞CD38表達(dá)，同時重組AAV傳遞編碼CD16-158V的HDR模板。雙編輯CD38KO/CD16KINK細(xì)胞的生成通過表面FLAG的表達(dá)來確定;58%的CD38KO細(xì)胞表達(dá)CD16-158V(圖4A)。雙編輯CD38KO/CD16KI NK細(xì)胞聯(lián)合DARA誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞裂解增加(圖4B)，并顯示MM1.S移植瘤小鼠中腫瘤負(fù)荷的最大減少，顯示出優(yōu)越的抗腫瘤活性(圖4C)。MaxCyte的電穿孔技術(shù)可以與互補(bǔ)的基因工程工具一起使用，比如AAV，開發(fā)下一代NK細(xì)胞療法。 　　
A)在CRISPR-Cas9 RNP電穿孔和AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)7天后測量FLAG陽性NK細(xì)胞的百分比。B)雙編輯(CD38KO/CD16KI)、單編輯(CD38KO)和未編輯(CD38WT) NK細(xì)胞在MM.1S靶細(xì)胞中增強(qiáng)DARA介導(dǎo)的裂解能力的比較。C)雙編輯NK細(xì)胞在異種移植小鼠中表現(xiàn)出更高的抗骨髓瘤活性。用于形成腫瘤的MM.1S細(xì)胞被慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)螢火蟲熒光素酶。在30天內(nèi)測量MM.1S骨髓瘤腫瘤生長的生物發(fā)光定量(光子每秒或總通量)。
 
 
結(jié)論及未來應(yīng)用
高效過繼NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移和單克隆抗體聯(lián)合治療是一種很有潛力的癌癥治療策略。MaxCyte的電穿孔技術(shù)與AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合，為NK細(xì)胞的多重基因工程開發(fā)了一種易于適應(yīng)的工作流程。利用MaxCyte®電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)的高效率CD38敲除消除了對工程細(xì)胞額外富集步驟的需要。此外，隨著時間的推移，CD38表達(dá)的減少是穩(wěn)定的，并賦予DARA誘導(dǎo)的NK自相殘殺行為耐藥性。電穿孔不會損害編輯NK細(xì)胞的功能或增殖能力。MaxCyte電穿孔也被用來用高親和力CD16-158V修飾CD38KO細(xì)胞，增強(qiáng)它們在DARA存在下的細(xì)胞毒性。電穿孔和AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)合導(dǎo)致了雙編輯NK細(xì)胞的高效生產(chǎn)。CD38KO/CD16KI NK細(xì)胞在體外和體內(nèi)均增強(qiáng)了DARA的抗腫瘤活性。MaxCyte為NK細(xì)胞的多重工程開發(fā)了一種簡化的工作流程，當(dāng)與DARA結(jié)合時，代表了一種令人興奮的組合免疫治療策略，可以完美地進(jìn)入臨床。
 

參考文獻(xiàn)
1. Wang Y, Zhang Y, Hughes T, et al. Fratricide of NK Cells in Daratumumab Therapy for Multiple Myeloma Overcome by Ex Vivo-Expanded Autologous NK Cells. Clin Cancer Res. 2018;24(16):4006-4017. doi:10.1158/1078-0432.CCR-17-3117.
 
2. Clara JA, Levy ER, Reger R, Barisic S, Chen L, Cherkasova E, Chakraborty M, Allan DSJ, Childs R. High-affinity CD16 integration into a CRISPR/Cas9-edited CD38 locus augments CD38-directed anti-tumor activity of primary human natural killer cells. J Immunother Cancer. 2022 Feb;10(2):e003804. doi: 10.1136/jitc-2021-003804. PMID: 35135865; PMCID: PMC8830298.
 
關(guān)于MaxCyte
MaxCyte (NASDAQ: MXCT)作為全球領(lǐng)先的細(xì)胞工程解決方案供應(yīng)商，新一代ExPERT流式電轉(zhuǎn)技術(shù)，作為專利性的非病毒GMP細(xì)胞工程平臺，為創(chuàng)新型細(xì)胞和基因療法插上翅膀，提供符合臨床治療和商業(yè)化的電轉(zhuǎn)平臺，MaxCyte已被全球范圍內(nèi)用戶認(rèn)可，全球前十制藥公司都采用MaxCyte技術(shù)平臺進(jìn)行藥物研發(fā)，支持了全球超過75個細(xì)胞與基因治療臨床項(xiàng)目，幫助加快科研到臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。幫助合作伙伴釋放它們產(chǎn)品的所有潛能，為全球生物醫(yī)藥行業(yè)的合作伙伴賦能。