1、如何根據(jù)工藝需求選擇基質(zhì)合適的離子填料

• 在捕獲階段，為初步分離富集目的產(chǎn)物，可選擇具有高結(jié)合載量，適應(yīng)高流速的大粒徑基質(zhì)，如TOSOH的EC（200μm）和C（100μm）型離子填料。

• 在中間純化階段，為除去大部分雜蛋白，可選擇具有高結(jié)合載量和高分辨率的中等粒徑基質(zhì)，如TOSOH的M（75或65μm）和S（35μm）型離子填料。

• 在精細(xì)純化階段，為獲得精純的樣品，可選擇具有極高分辨的TSKgel系列柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2、根據(jù)蛋白pI選擇離子交換填料類型

對于已知等電點(diǎn)蛋白：

如果蛋白在等電點(diǎn)之下最穩(wěn)定，緩沖液pH≤目的蛋白pI，選擇陽離子交換劑。

如果蛋白在等電點(diǎn)之上最穩(wěn)定，緩沖液pH≥目的蛋白pI，選擇陰離子交換劑。

• 緩沖液pH≥目的蛋白pI 0.5-3個(gè)單位選擇弱陰離子交換填料；

• 緩沖液pH≥目的蛋白pI 3個(gè)單位以上選擇強(qiáng)陰離子交換填料；

• 緩沖液pH≤目的蛋白pI 0.5-3個(gè)單位選擇弱陽離子交換填料； 

• 緩沖液pH≤目的蛋白pI 3個(gè)單位以上選擇強(qiáng)陽離子交換填料；

• 緩沖液中含有較高離子強(qiáng)度時(shí)選擇復(fù)合型離子交換填料，如TOSOH的Toyopearl NH2-750F和 Toyopearl Sulfate-650F填料。

對于未知等電點(diǎn)蛋白：

首先應(yīng)選擇陰離子交換劑，起始平衡液pH8.0；

然后填料再嘗試陽離子交換劑，起始平衡液pH6.0。

3、加載樣品時(shí)流穿峰里有未結(jié)合目標(biāo)蛋白

• 加載樣品量過多，超出柱子的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，可降低上樣量；

• 上樣流速過快，可降低上樣流速，增加孵育時(shí)間；

• 柱料被污染，結(jié)合能力下降，應(yīng)對層析柱進(jìn)行清洗及再生；

• 緩沖液選擇不合適，優(yōu)化緩沖液pH和離子強(qiáng)度。

4、樣品未按預(yù)期洗脫下來或產(chǎn)量較低

• 洗脫強(qiáng)度不夠，增大洗脫液離子強(qiáng)度；

• 目標(biāo)蛋白與柱料結(jié)合過于緊密，應(yīng)調(diào)整初始平衡液的pH；

• 目標(biāo)蛋白在洗脫過程中發(fā)生聚集，沉淀柱上，應(yīng)優(yōu)化洗脫條件，保證蛋白穩(wěn)定性；

• 目標(biāo)蛋白與柱料發(fā)生非特異性吸附，可適當(dāng)降低鹽離子強(qiáng)度，減少疏水相互作用；

• 目標(biāo)蛋白可能被蛋白酶降解，添加適量的蛋白酶抑制劑。

 5、樣品峰拖尾

• 錯(cuò)誤的初始緩沖液，調(diào)整pH和緩沖液離子強(qiáng)度；

• 樣品粘性過大，用初始緩沖液對樣品進(jìn)行稀釋；

• 層析柱裝填過于松散或柱床上端被壓縮，出現(xiàn)液面，需重新裝柱。

 6、目標(biāo)蛋白不能與其他雜質(zhì)峰分開

• 錯(cuò)誤的初始緩沖液，調(diào)整pH和緩沖液離子強(qiáng)度，并保證上樣前柱子平衡完全；

• 洗脫條件不佳，優(yōu)化洗脫條件，降低流速，調(diào)整pH，使用更平緩的梯度；

• 層析柱分離效果不好，柱效差，檢查柱效，確定是否需重新裝柱或更換預(yù)裝柱；

• 目標(biāo)蛋白在洗脫時(shí)被部分降解，添加適量的蛋白酶抑制劑；

• 樣品粘性過大，用初始緩沖液對樣品進(jìn)行稀釋，保證樣品濃度在50mg/ml之下；

• 分離柱頂端或底部死體積過大，使樣品混合，將頂部適配器靠近柱床表面，減少柱后管路體積。
  
  
  
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