等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種核酸分子診斷技術(shù)，從誕生之日起就不斷受到研究者的青睞，但也少不了質(zhì)疑，甚至摒棄。引起這種截然相反的態(tài)度的原因在于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)自身所存在的缺陷。而最為突出的一點(diǎn)是，在建立方法或者實(shí)際樣本檢測(cè)的過程中，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)引起假陽性結(jié)果的概率相對(duì)較高，使得其實(shí)際應(yīng)用范圍變窄，未能真正顯示出其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。因此，推出這經(jīng)驗(yàn)篇來回答“當(dāng)?shù)葴財(cái)U(kuò)增出現(xiàn)假陽性時(shí)應(yīng)該如何應(yīng)對(duì)？”。

01假陽性現(xiàn)象  

假陽性是指檢測(cè)陰性材料得到陽性結(jié)果。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照中出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)陽性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可能有假陽性。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

02  造成假陽性的原因  

1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣*污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染； 

2. 擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物拷貝量大，所以極微量的產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

3. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣*的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆�？珊�48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。 

4. 實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題比較常見。 

03  假陽性問題的試驗(yàn)控制  

在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，可設(shè)立陰性對(duì)照樣品和陽性對(duì)照樣品。陰性對(duì)照樣品檢測(cè)為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對(duì)照樣品檢測(cè)為陽性時(shí)，表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對(duì)照樣品和陽性對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，才能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行判定。只有設(shè)立試驗(yàn)全程的對(duì)照，才能證明試驗(yàn)結(jié)果成立。 

造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗(yàn)對(duì)照來查找。

試驗(yàn)對(duì)照包括： 

1、DNA陽性對(duì)照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒）作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確及待測(cè)樣品中是否含有目的片段。（注意：陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制，避免其成為潛在的污染源）。

2、DNA陰性對(duì)照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。

3、空白對(duì)照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。

4、等溫?cái)U(kuò)增抑制物對(duì)照：在與陽性對(duì)照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測(cè)樣品DNA，如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測(cè)樣品DNA中存在擴(kuò)增抑制物。 

5、空白提取對(duì)照：空白提取對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。 

6、陽性提取對(duì)照：陽性提取對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。 如果DNA陽性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，或者DNA陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。 

04  假陽性解決途徑  

由于擴(kuò)增的敏感性和效率特別高，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反應(yīng)管即可出現(xiàn)假陽性。尤其是擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實(shí)驗(yàn)室的污染，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。 

1、規(guī)范實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 

實(shí)驗(yàn)室設(shè)置上分配液區(qū)、DNA提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴(yán)禁倒流。在連續(xù)而獨(dú)立的空間中完成不同實(shí)驗(yàn)步驟。不同工作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。 

2、規(guī)范試劑耗材管理 

1）驗(yàn)證：新買的試劑需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前驗(yàn)證； 

2）分裝：雙蒸水、引物和dNTP均應(yīng)分裝儲(chǔ)存，并標(biāo)明日期，以防污染；試劑的分裝應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行；試劑分裝成小份一次使用后棄去。 

3）消毒：除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。必要時(shí)，在加樣本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 

3、規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作 

1）控制污染源：擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒操作空間是最大的污染源，應(yīng)嚴(yán)格防止將這個(gè)空間的物品帶出；

2）一次性用具：使用實(shí)驗(yàn)服和一次性手套，使用帶有濾膜的移液器*頭，一次性反應(yīng)管和離心管； 

3）定期消毒：定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行紫外照射，用10%漂白劑、3％雙氧水或?qū)Ｓ蒙虡I(yè)產(chǎn)品清理實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面及死角。 

4）定期通風(fēng)：對(duì)實(shí)驗(yàn)室定期進(jìn)行正壓、負(fù)壓通風(fēng)處理；

5）小心操作：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣*內(nèi)或?yàn)R出離心管外；加樣時(shí)，最后加陽性對(duì)照。 
 

05 面對(duì)實(shí)驗(yàn)的假陽性個(gè)人建議  

1、端正心態(tài)，堅(jiān)持不懈地探索。

2、引物設(shè)計(jì)要過關(guān)。

3、關(guān)注Bst DNA聚合酶的選擇和質(zhì)量。

4、關(guān)注dNTPs的質(zhì)量。dNTPs建議分裝保存在-20℃。低質(zhì)量的dNTPs不僅導(dǎo)致陽性擴(kuò)增效率下降，還能引起非特異性擴(kuò)增，即假陽性結(jié)果。

5、關(guān)注引物的質(zhì)量。如果是引物質(zhì)量引起的假陽性。

解決的對(duì)策有：

（1）提高純化級(jí)別至HPLC，以排除引物干粉摻雜物對(duì)體系的影響；

（2）選擇質(zhì)量過硬的合成機(jī)構(gòu)；

（3）嚴(yán)格遵循引物保存的條件：干粉和高濃度引物液-20℃可保存數(shù)月；非干粉和工作濃度引物液4℃保存不超過一周。

6、優(yōu)化反應(yīng)體系。對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)而言，優(yōu)化反應(yīng)體系是解決假陽性擴(kuò)增最為直接、有效的方法。當(dāng)然，在進(jìn)行體系優(yōu)化前，要保證所有體系成分都不會(huì)引起假陽性。換言之，要確認(rèn)好是反應(yīng)體系配方引起的假陽性。

7、樣本成分耐受性影響。在建立等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)時(shí)我們往往會(huì)忽略實(shí)際樣本成分給擴(kuò)增帶來的影響。由于實(shí)際樣本絕非是純的核酸樣本，縱使用最好的純化試劑盒，部分樣本成分仍然會(huì)出現(xiàn)在最終提取液中。這些樣本成分包括尿素、尿酸、血清、血清、膽汁酸等，在等溫?cái)U(kuò)增時(shí)會(huì)使陽性反應(yīng)速率變慢，誘發(fā)假陽性擴(kuò)增或假陰性結(jié)果。因此，一個(gè)好的檢測(cè)試劑盒，必須對(duì)一定量的樣本成分有很好的耐受性。建議在方法構(gòu)建好之后，進(jìn)行實(shí)際樣本檢測(cè)或者模擬實(shí)際樣本檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。

04 總結(jié)  

上述建議并非是解決假陽性問題的黃金鑰匙，可做大家參考。相信其他從事等溫?cái)U(kuò)增研究的人也都有其解決假陽性問題的經(jīng)驗(yàn)與方法。彼此經(jīng)驗(yàn)共享對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增研究領(lǐng)域的健康發(fā)展是至關(guān)重要的。如果你恰巧有這方面的經(jīng)驗(yàn)或者問題，不妨關(guān)注我們公眾號(hào)告知我們，我們會(huì)將經(jīng)驗(yàn)共享于大家，將問題與大家一起探討，讓彼此也少走些彎路。