隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)特定基因研究的小鼠模型構(gòu)建也越來(lái)越成熟。但是，構(gòu)建成功的模型小鼠要用于實(shí)驗(yàn)，還需要漫長(zhǎng)的繁育之路要走。行百里者半九十，你以為模型構(gòu)建成功了就結(jié)束了嗎？NO NO NO！繁育是提供合格實(shí)驗(yàn)材料過(guò)程中的臨門一腳。

特別是對(duì)于CKO、CKI這些組織特異性的模型小鼠，需要與cre工具鼠配繁，才能得到在特定組織敲除或敲入的目的小鼠。而基于cas9[1]技術(shù)制作的CKI小鼠，對(duì)于不同的構(gòu)建策略，繁育之路也是不同的。這一點(diǎn)需要涉及Cas9-CKI繁育工作的研究人員注意。否則，三周懷胎，一朝分娩，含辛茹苦到斷乳，最終還是寶寶心里苦。

Cas9-CKI小鼠的構(gòu)建過(guò)程分體外和體內(nèi)兩個(gè)階段：

 

1.F0 代繁育原則：

1) 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶獲得到的小鼠，由于Cas9系統(tǒng)在受精卵階段對(duì)基因進(jìn)行編輯，在F0代可能出現(xiàn)多種基因型并存的狀態(tài)。Cas9技術(shù)制作的小鼠不帶有Neo標(biāo)記基因，但是會(huì)產(chǎn)生多條line，F(xiàn)0要分line繁育。

2) 陽(yáng)性F0代小鼠和野生型背景鼠回交后，所得到的后代基因型將會(huì)單一。

3) F0代小鼠之間不能相互交配。

2. F1代及F1代之后繁育原則：

1) 由F0代小鼠和野生型背景鼠交配得到的后代小鼠稱為F1代。

2) 陽(yáng)性F1代小鼠可用于保種建系。

Cas9-CKI小鼠的模型構(gòu)建主要有2個(gè)策略，雖然繁育原理不同，但是其繁育路線大致相同；下面跟大家介紹一下兩個(gè)不同構(gòu)建策略制作的Cas9-CKI小鼠的繁育路線。

 

構(gòu)建策略I

使用loxp-stop-loxp系統(tǒng)[2]進(jìn)行條件性表達(dá)靶基因時(shí)（如下圖），在未刪除loxp片段之前，小鼠表達(dá)野生型基因，在刪除loxp片段后，小鼠表達(dá)點(diǎn)突變后基因。

 

配繁原則是配cre工具鼠，刪除stop元件，構(gòu)建KI小鼠或者組織特異性KI小鼠。

 

構(gòu)建策略II

使用loxpmut-cre系統(tǒng)[3]進(jìn)行條件性表達(dá)靶基因時(shí)（如下圖），

 

配繁原則是CKI小鼠配cre工具鼠，野生型的loxp之間的基因首先發(fā)生倒置，使得lox2272位點(diǎn)變?yōu)橥�向，同時(shí)發(fā)生片段刪除，表達(dá)預(yù)期的靶位點(diǎn)，所以通過(guò)配繁不同的cre工具小鼠，可以獲得不同組織表達(dá)的基因的定點(diǎn)突變。

 

繁育路線一

目標(biāo)得到全身插入小鼠

1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代陽(yáng)性鼠（F1代小鼠需測(cè)序）；選擇需要的line繁育；

2.陽(yáng)性F1代Fl/wt小鼠配全身性cre小鼠，得到KI/wt-creT小鼠（全身敲入目的基因且?guī)в衏re基因）；

3.KI/wt-creT小鼠配背景鼠，得到KI/wt-creW小鼠（全身敲入目的基因且不帶有cre基因）；

4.KI/wt-creW小鼠互配得到KI/KI-creW小鼠。（全身敲入目的基因純合小鼠）

 

繁育路線二

目標(biāo)得到組織特異性插入小鼠

1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代陽(yáng)性鼠（F1代小鼠需測(cè)序）；選擇需要的line繁育；

2.陽(yáng)性F1代Fl/wt小鼠配組織特異性cre小鼠，得到fI/wt-creT小鼠（組織特異性敲入目的基因且?guī)в衏re基因）；

3.fI/wt-creT小鼠配fI/wt-creW或fI/wt小鼠，得到fI/fl-creT小鼠。（組織特異性敲入目的基因純合小鼠）

 

繁育路線三

目標(biāo)得到flox小鼠

1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代陽(yáng)性鼠（F1代小鼠需測(cè)序）；選擇需要的line繁育；

2.陽(yáng)性F1代Fl/wt小鼠互配，得到fI/fl小鼠。（組織特異性敲入flox純合小鼠）

 

Cas9-CKI小鼠繁育還是比較專業(yè)的，但是理清了思路就明白其中奧秘了。對(duì)于需要配cre工具鼠的CKI小鼠來(lái)說(shuō)，如果想要得到純合插入的小鼠，使用的cre應(yīng)避免與目的基因在同一染色體上，否則得不到純合插入小鼠。萬(wàn)里陽(yáng)光道，不負(fù)上心人，在小鼠繁育的道路上，你多上點(diǎn)心知道的多一點(diǎn)，就更能把握正確的方向。

漫漫科研路，莘莘同行人，加油~

 

參考文獻(xiàn)

[1] Shalem O , Sanjana N E , Hartenian E , et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014, 343(6166):84-87.

[2] Sblattero D , Lou J , Marzari R , et al. In vivo recombination as a tool to generate molecular diversity in phage antibody libraries[J]. journal of biotechnology, 2001, 74(4):303-315.

[3] Yu G , Xin-Tai Z . A New Combination of Mutated loxPs in a Vector for Construction of Phage Antibody Libraries[J]. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica(7):7.