上一講中我們已經(jīng)了解到單細胞測序的重要性及應(yīng)用方向。

而單細胞測序日趨火爆的原因很大程度上得益于單細胞分離技術(shù)的不斷完善。這一講，我們將跟大家一起回顧傳統(tǒng)的單細胞分離技術(shù)，并重點介紹單細胞分離技術(shù)的新寵微孔芯片技術(shù)及微流控技術(shù)。圖1為目前常見單細胞分離設(shè)備。

圖1：目前常見單細胞分離設(shè)備

傳統(tǒng)單細胞分離技術(shù)

相信許多實驗人員，都見過下面我們要介紹的傳統(tǒng)的單細胞分離設(shè)備。傳統(tǒng)的單細胞分離方法主要有：口吸管技術(shù)、顯微操作法、激光顯微切割法及流式細胞法。

利用口吸管技術(shù)，操作者可以在顯微鏡下選擇形態(tài)較好的細胞，對細胞幾乎無損傷，因此下游實驗的成功率非常高，但對操作人員的熟練度要求較高，見圖2。

圖2：顯微鏡下采集單細胞

手工操作分離單細胞費時費力。而顯微操作儀的發(fā)明解放了人手，使得整個操作過程更加簡單可控。利用顯微操作儀，見圖3，操作者可以通過手動或者自動化的辦法實現(xiàn)單細胞獲取。與口吸管相比，顯微操作的優(yōu)勢在于能夠通過儀器準確地控制單細胞的吸取與釋放，因此對操作人員自身的技術(shù)要求降低。

圖3：Eppendorf顯微操作儀

利用激光顯微切割儀，見圖4，操作者可以將組織內(nèi)單一細胞或細胞群切割下來進行研究，避免間質(zhì)細胞及一些炎癥細胞造成背景“污染”，可以了解到細胞的位置信息。但該方法相鄰細胞容易污染，另外在組織固定及激光切割的過程中可能會破壞細胞的完整性，對細胞核酸損傷較大，從而影響后續(xù)的遺傳物質(zhì)的擴增。

圖4：ArcturusXT^TM激光顯微切割儀

流式細胞儀，原理見圖5，能夠?qū)η室喊�裹著的單細胞實現(xiàn)散射光及熒光的檢測。分選型的流式細胞儀通過對鞘液施加超高速震動使液流形成液滴，并進行瞬時充電。包裹單細胞的帶電液滴經(jīng)過高壓電場后發(fā)生偏轉(zhuǎn)，進入收集裝置中，從而實現(xiàn)細胞的分離。

流式細胞儀技術(shù)能夠很好的實現(xiàn)大量細胞及復(fù)雜樣本的分選，并且能夠做到精度高、通量較大（96或384）。但是流式機械剪切力比較大，影響細胞活性，同時要求的細胞數(shù)量多，對于一些無法獲取足夠數(shù)目細胞的項目來說是不適用的。

圖5：流式細胞分選儀分選原理

以上傳統(tǒng)的單細胞分離技術(shù)可以幫助研究者獲取單個細胞，但并不能同時做到下游的擴增。需要操作者對分離到單個PCR管中的細胞進行后續(xù)的裂解、擴增及建庫，仍然需要繁瑣的操作。因此我們下面將重點介紹新型的高通量單細胞分離技術(shù)－微孔芯片技術(shù)及微流控技術(shù)。

新型高通量單細胞分離技術(shù)

目前新型高通量單細胞分離技術(shù)主要有微孔芯片技術(shù)及微流控技術(shù)。

微孔芯片技術(shù)是指通過制作個孔徑略大于細胞直徑的微孔陣列，通過重力、流體、電場等方式將細胞懸液中的單細胞分離至微孔中的技術(shù)。
 
目前隸屬于Takara Bio的WaferGen生物系統(tǒng)公司于2014年推出了ICELL8^TM Single-Cell System（圖6），通過MultiSample NanoDispenser（MSND）能夠準確的對ICELL8芯片上搭載的5184個微孔進行分注。成像階段可以得到各個微孔的圖像，結(jié)合專用軟件CellSelect自動選擇單細胞進行后續(xù)的實驗。

圖6：ICELL8^TM Single-Cell System成像分析

Alex K. Shalek等開發(fā)了便攜式單細胞分離技術(shù)可以快速和低成本地進行單細胞RNA測序。他們設(shè)計了捕捉單個細胞的納米微孔陣列，見圖7，用有條形碼的磁珠捕獲RNA片段。僅需要移液槍即可實現(xiàn)單細胞的高通量分選。Seq-well過程能夠很好捕獲和分析序列約每個細胞10至15%的RNA轉(zhuǎn)錄本。

圖7：Seq-well（Nature Methods 14, 395–398 (2017)）

微流控技術(shù)是指通過微米級別的流道精確操控微升、毫升級別樣品的技術(shù)，目前主要有微反應(yīng)室、液滴技術(shù)。微流控技術(shù)在細胞分選應(yīng)用方面優(yōu)勢巨大，可利用重力離心、流體力學(xué)、電場力等來捕獲細胞，同時還可以將多種操作單元結(jié)合在一起，集細胞捕獲、細胞培養(yǎng)、細胞裂解及后續(xù)的檢測分析于一體，實現(xiàn)高通量、自動化、集成化。

微反應(yīng)室（microchamber）

運用流體技術(shù)實現(xiàn)單細胞分選的商業(yè)化產(chǎn)品中較為有名的有Fluidigm 公司的C1 單細胞自動制備系統(tǒng)（圖8）。該系統(tǒng)基于Fluidigm創(chuàng)新的微流體技術(shù)，將溶液中的細胞樣品加在C1^TM微流體芯片上，快速自動分離出 96 或384個單細胞并分配到單個制備倉中；之后在芯片上進行細胞裂解、RNA反轉(zhuǎn)錄及預(yù)擴增。

圖8：Fluidigm 公司的C1 單細胞自動制備系統(tǒng)

液滴技術(shù)

圖9：液滴技術(shù)（Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 25; 106(34): 14195–14200.）

液滴技術(shù)（圖9）是通過水溶液和油相從不同的微通道中流出并融合，形成一個“油包水”的乳液滴。將液滴技術(shù)運用到單細胞分離技術(shù)中即將單個細胞、反應(yīng)試劑等通過微滴生成裝置包被在一個油滴中形成油包水的微反應(yīng)體系。

目前市場代表產(chǎn)品主要有10x Genome公司的Chromium^TMController（見圖10）和Illumina聯(lián)合Bio-Rad推出的ddSEQ Single-Cell Isolator。這兩款單細胞分離儀器在設(shè)計原理上有一定的相似度，能在數(shù)分鐘內(nèi)形成百萬個液滴，可以達到上萬個細胞同時分離、擴增，由于每個細胞攜帶不同的分子標簽進行區(qū)分，后續(xù)可以允許大量細胞同時在一個反應(yīng)體系中擴增，因此通量很大同時消耗的試劑量低，最終折合到每個單細胞的費用低，成為目前單細胞轉(zhuǎn)錄組研究的明星產(chǎn)品。

圖10：10x Genome公司的Chromium^TMController

結(jié)束語

相信大家對單細胞分離技術(shù)已經(jīng)有了初步的了解，最后我們也對目前的單細胞分離技術(shù)進行了一下總結(jié)比較。

單細胞分離技術(shù)總結(jié)如下表：

我們擁有的技術(shù)

華大作為一直在高通量測序研究領(lǐng)域走在前列的機構(gòu)，多年來在單細胞分離中積累了豐富的經(jīng)驗。目前已經(jīng)擁有包括口吸法、 顯微操作、顯微切割、流式分離、ICELL8、Chromium^TM單細胞分離的多個低、高通量的分離平臺以及對應(yīng)的后續(xù)擴增建庫解決方案。

參考文獻

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[2] Macosko, Evan , Basu, Anindita, Satija, & Rahul, et al. (2015). Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell, 161(5), 1202-14.
[3]Todd M Gierahn, Marc H Wadsworth II, Travis K Hughes, et al. Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nature Methods 14, 395–398 (2017)