體外暴露染毒技術(shù)改進(jìn)后實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的提高

目前的體外暴露染毒研究中，受試物可在氣液界面直接與細(xì)胞接觸（Cultex），避免了傳統(tǒng)浸沒(méi)培養(yǎng)暴露中培養(yǎng)基成分對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。在此氣-液界面體外暴露染毒過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性（穩(wěn)定性和再現(xiàn)性）取決于細(xì)胞體外暴露染毒技術(shù)及暴露系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

 

在文獻(xiàn)中，我們常見(jiàn)到的受試物在氣液界面直接與細(xì)胞暴露接觸的體外暴露染毒方案有不同類型（Aufderheide，2005；Aufderheide et al.，2005）。在這里，我們把兩個(gè)主要應(yīng)用的模塊類型，即線性流體外暴露染毒系統(tǒng)（Linear Flow System）和輻射流體外暴露染毒系統(tǒng)（Radial Flow System）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試對(duì)比，以討論這兩種方法的差異。

 

2.1  體外暴露染毒系統(tǒng)

2.1.1 CULTEX CG(線性流暴露染毒系統(tǒng)Linear Flow System) 第一代氣液界面體外暴露染毒系統(tǒng) 見(jiàn)圖1，主要特點(diǎn)是細(xì)胞培養(yǎng)小室及進(jìn)氣氣溶膠入口線性分布，上下兩個(gè)模塊形成緊密的封閉系統(tǒng)。底部模塊為細(xì)胞培養(yǎng)部分，具備37℃水浴及可流動(dòng)的培養(yǎng)基供給；頂部是與培養(yǎng)小室對(duì)應(yīng)分布的線性的氣體進(jìn)出模塊，通過(guò)在后端連接的抽氣泵，在密閉腔室內(nèi)實(shí)現(xiàn)負(fù)壓，所需暴露物質(zhì)不停進(jìn)入密閉系統(tǒng)內(nèi)完成暴露染毒后才從后端排出。細(xì)胞培養(yǎng)小室中形成良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，其中的細(xì)胞并可與頂部進(jìn)來(lái)的氣體進(jìn)行直接接觸，實(shí)現(xiàn)直接的氣液界面暴露。該系統(tǒng)適用12 mm細(xì)胞培養(yǎng)小室。

 

                圖1 CULTEX CG  (線性流體外暴露染毒系統(tǒng)Linear Flow System)

 

2.1.2  CULTEX RFS(輻射流暴露染毒系統(tǒng)Radial Flow System)  第二代暴露氣液界面體外暴露染毒系統(tǒng) 見(jiàn)圖2，圖3，是一套全新設(shè)計(jì)的體外暴露染毒系統(tǒng)模塊。采用新型的輻射性管理氣路設(shè)計(jì)：底部模塊中的細(xì)胞培養(yǎng)（三個(gè)或六個(gè)）小室呈對(duì)稱輻射分布、頂部模塊的進(jìn)氣口直接分成輻射對(duì)照分布的三個(gè)（或六個(gè)）進(jìn)氣通道，密閉后頂部進(jìn)入氣體直接與底部小室內(nèi)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行接觸暴露。同時(shí)系統(tǒng)提供可持續(xù)流動(dòng)的培養(yǎng)基以及360度分布的水浴，保證體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。

 

    

圖3 線性流體外暴露染毒系統(tǒng) CULTEX RFS 結(jié)構(gòu)模式圖

 

 

圖4線性流體外暴露染毒系統(tǒng) CULTEX RFS 結(jié)構(gòu)模式圖

 

2.1.3  CULTEX DG顆粒物氣溶膠發(fā)生器（ Wright 1950 ），全自動(dòng)干粉狀顆粒物氣溶膠發(fā)生器，進(jìn)料速度 800 U/min, 氣流大小 8 L/min，暴露的時(shí)間和顆粒類型見(jiàn)附表1。

 

表格1  實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的主要參數(shù)

 

2.1.4  全自動(dòng)香煙煙霧發(fā)生器，K3R4F 研究性香煙（University of Kentucky, Lexington, KY, USA），吸煙參數(shù)設(shè)置35 mL puff volume/2 s, 1 puff per minute, 7 puffs per cigarette，通氣流量1L/min。

2.1.5  顆粒物沉積，顆粒物沉積如圖5所示，在細(xì)胞小室內(nèi)沉積的顆粒物均在玻璃纖維膜上(Type: MNGF-1; Machery-Nagel, Germany)，玻璃纖維膜通過(guò)Clip Fit（圖4）裝置固定在細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)，實(shí)驗(yàn)稱重分析天平(SE2F Microbalance, readability: 0.1 mg; Sartorius GmbH, Germany)。

 

                                圖4    Clip Fit固定支架

圖5 顆粒物沉積模式圖

 

不同粒徑及質(zhì)量的顆粒物在兩種不同暴露染毒模塊內(nèi)有不同的沉積結(jié)果。通常情況下，雖然粒子的理化性質(zhì)及粒徑大小可能會(huì)對(duì)顆粒沉積有影響，但在同一粒子的暴露結(jié)果可以看出，輻射流暴露染毒系統(tǒng)CULTEX RFS中三個(gè)位置暴露數(shù)據(jù)的具有更低的偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都在5%以內(nèi)。線性流暴露染毒系統(tǒng)CULTEX CG的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差全部大于10%，其精密度及三通道間的實(shí)驗(yàn)平行性及重復(fù)性均較差。

 

表格2  Pural 200暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質(zhì)量及分析

 

3.1 高純氧化鋁Pural 200

3.1.1高純氧化鋁Pural 200的粒徑范圍為40納米～40微米。線性流暴露染毒系統(tǒng)和輻射流暴露染毒系統(tǒng)采用同一個(gè)氣溶膠發(fā)生器進(jìn)行發(fā)生。相同暴露時(shí)間后，暴露前后分別對(duì)玻璃纖維膜進(jìn)行稱重，獲得膜上沉積顆粒重量見(jiàn)附表2。

 

3.1.2兩個(gè)暴露模塊實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，平均而言，在顆粒物沉積的質(zhì)量上，線性流暴露染毒系統(tǒng)超過(guò)輻射流暴露染毒系統(tǒng)。但在同一時(shí)間，輻射流暴露染毒系統(tǒng)的三暴露染毒位置獲得的數(shù)值變化幅度顯著減小。這意味著，輻射流暴露染毒系統(tǒng)三個(gè)腔室能夠更加平等的分布顆粒，通道間的平行性更好，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性更佳。為了研究這方面，我們進(jìn)一步研究其他兩種顆�；�合物氧化銅微米顆粒和氧化銅納米顆粒。

 

3.2 氧化銅微米顆粒

氧化銅顆粒粒徑＜5mm，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示，我們觀察到1、輻射流暴露染毒系統(tǒng)中的沉積數(shù)據(jù)具有非常高的重復(fù)性，而線性流暴露系統(tǒng)沉積的數(shù)據(jù)偏差相當(dāng)大；2、顆粒在玻璃纖維膜上沉積的分布差異非常大如圖6，線性流暴露系統(tǒng)中顆粒主要集中分布在膜中央，而輻射流暴露系統(tǒng)中顆粒非常均勻的分布在整張膜表面上。

 

圖6  氧化銅微米顆粒在玻璃纖維膜上沉積效果

 

表格3  氧化銅微米顆粒暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質(zhì)量及分析

表格4  氧化銅納米顆粒暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質(zhì)量及分析

 

3.3 氧化銅納米顆粒

氧化銅顆粒粒徑＜42nm，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4所示，觀察到與氧化銅微米顆粒實(shí)驗(yàn)類似的效果，線性流暴露系統(tǒng)沉積的數(shù)據(jù)偏差比輻射流暴露系統(tǒng)高很多，而玻璃纖維膜上顆粒的沉積分布輻射流暴露系統(tǒng)則更加均勻一致如圖7。

 

 

圖7  氧化銅納米顆粒在玻璃纖維膜上沉積效果

 

表格5  K3R4F煙氣顆粒暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質(zhì)量及分析

 

3.4 主流煙（K3R4F research cigarettes）

香煙煙霧的對(duì)比實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了前面實(shí)驗(yàn)所取得的結(jié)果，數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。如表5數(shù)據(jù)所示，我們可分析認(rèn)為線性流暴露系統(tǒng)中顆粒沉積具有非常大的不穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)偏離較高，輻射流暴露系統(tǒng)具有非常穩(wěn)定而可重復(fù)的顆粒沉積效應(yīng)。

 

在受試物為氣體時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)小室和氣溶膠入口是否為線性排列，并不重要，因?yàn)椋瑲怏w的分布是均勻的。但當(dāng)受試物為顆粒物氣溶膠時(shí)，由于其具有復(fù)雜顆粒物粒徑大小分布及物理化學(xué)性質(zhì)，其線性方向運(yùn)輸將對(duì)其顆粒物的沉積產(chǎn)生非常大的影響。（1）顆粒物濃度及粒徑分布在稀釋系統(tǒng)中的穩(wěn)定性收到影響；（2）在不同的細(xì)胞小室上沉積的粒子濃度及粒徑將發(fā)生變化，導(dǎo)致在不同的細(xì)胞小室內(nèi)沉積顆粒的平行性和重復(fù)性較差。顯然，壓縮空氣的進(jìn)氣稀釋是無(wú)法打破受試物質(zhì)的層流分布，這將無(wú)法改變?nèi)缟纤�述沉積效應(yīng)的產(chǎn)生。

 

考慮到這些缺點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)小室和氣溶膠入口分布需要進(jìn)行根本性的改變。為了避免受試顆粒物暴露的不均勻性，Cultex推出的全新概念的二代暴露染毒模塊Cultex RFS。在這里，氣溶膠將通過(guò)一個(gè)帶有噴嘴(Mohr, 2013)的中央入口統(tǒng)一進(jìn)入，在噴嘴處氣溶膠將均勻分散到三個(gè)中央輻射分布的通道內(nèi)，通過(guò)該通道進(jìn)入輻射分布的細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)，如此過(guò)程后，氣溶膠在三個(gè)細(xì)胞小室內(nèi)沉積的均一性和重復(fù)將大大提高。該實(shí)驗(yàn)中不同顆粒沉積后的圖片和數(shù)據(jù)結(jié)果都顯示了非常好的效果，三個(gè)細(xì)胞小室間顆粒沉積偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差都非常理想。與第一代線性流系統(tǒng)比較，我們發(fā)現(xiàn)二代輻射流暴露染毒模塊損失了部分顆粒，即每個(gè)細(xì)胞小室內(nèi)沉積顆�？傎|(zhì)量在減少。這是由于Cultex RFS模塊中我們?cè)黾恿舜箢w粒物（凝聚粒子）預(yù)分離技術(shù)，降低了大的或凝聚在一起的顆粒沉積到細(xì)胞表面的可能，即提供了顆粒物粒徑分布的均一性，使實(shí)驗(yàn)受試物更穩(wěn)定，既減小了粗顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，又進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性。

 

總之，體外暴露染毒模塊結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)優(yōu)化，對(duì)體外暴露染毒實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的提高起到革命性作用，具有劃時(shí)代的意義。