多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物,由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成。多肽是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)片段,也是蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的活性基團(tuán),是人體進(jìn)行代謝、調(diào)控活動的重要物質(zhì)。蛋白質(zhì)主要以多肽形式吸收,透過多肽既可深入研究蛋白質(zhì)的性質(zhì),又為改變和合成新的蛋白質(zhì)提供了基礎(chǔ)材料。研究多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便應(yīng)用中設(shè)計盡可能短的多肽同時提高其生理活性,減少臨床的不良反應(yīng)。隨著美國FDA1999年開始允許大豆蛋白制品標(biāo)注可以預(yù)防心血管疾病的功能和人們對多肽中各氨基酸系列的功效的不斷了解,作為藥物和營養(yǎng)品的多肽產(chǎn)品不斷被開發(fā)出來,多肽的研發(fā)已成為近年生命科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)[1~7]。

　　1 多肽的合成

　　1.1 多肽合成的分類

　　多肽合成主要有兩條途徑:化學(xué)合成和生物合成�；瘜W(xué)合成主要通過氨基酸縮合反應(yīng)來實現(xiàn)。為得到具有特定順序的合成多肽,當(dāng)合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體時,應(yīng)將不需要反應(yīng)的基團(tuán)暫時保護(hù)起來,然后再進(jìn)行連接反應(yīng),以保證合成的定向進(jìn)行。

　　多肽的化學(xué)合成有固相合成和液相合成之分,其主要的區(qū)別在于是否使用固相載體。多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略,逐步合成簡潔迅速,被用于各種生物活性多肽片段的合成;片段組合法為合成含100個以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線,并已成功地合成了多種有生物活性的多肽,其最大的特點(diǎn)是易于純制。1963年,Merrifield創(chuàng)立了固相合成法,將氨基酸的C末端固定在不溶樹脂上,然后在此樹脂上依次縮合氨基酸、延長肽鏈。固相合成法又可分為Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9-芴甲基氧羰基)法。在傳統(tǒng)液相和固相合成多肽方法的基礎(chǔ)上,人們又發(fā)展了氨基酸的羧內(nèi)酸酐(NCA)法、液相分段合成法、組合化學(xué)法等。

　　在生物合成多肽方面,除了常用的發(fā)酵法、酶解法外,隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展,DNA重組技術(shù)也被應(yīng)用于多肽合成。

　　1.2 氨基酸的羧內(nèi)酸酐法[8,9]

　　氨基酸的羧內(nèi)酸酐是氨基酸的一種衍生物,它的氨基保護(hù)基也活化羧基。NCA法屬于陰離子開環(huán)聚合機(jī)理,其引發(fā)劑可選用多種親核試劑或堿類。采用NCA法合成多肽的基本反應(yīng)包括:在堿性條件下,氨基酸陰離子進(jìn)攻NCA形成較為穩(wěn)定的氨基甲酸根離子,在酸化時該離子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又進(jìn)攻其它的NCA,如此反復(fù)進(jìn)行下去(圖1)。

　　NCA法具有合成周期短、操作簡單、成本較低、產(chǎn)物分子量高等優(yōu)點(diǎn),在目前多肽合成中所占比例較大,技術(shù)也較為通用。但是,采用NCA逐步法只能合成短鏈多肽片段[9]。

　　1.3 液相分段合成法[10~19]

　　液相分段合成法是多肽片段在溶液中依據(jù)其化學(xué)專一性或化學(xué)選擇性,自發(fā)連接成長肽的合成方法,其優(yōu)點(diǎn)是能得到長肽,但技術(shù)還不完善。常用的連接技術(shù)主要有:天然化學(xué)連接[11]、化學(xué)區(qū)域選擇連接[12,13]、可去除輔助基連接[14]、光敏感輔助基連接[15]、施陶丁格連接[16,17]和正交化學(xué)連接[18,19]。

　　天然化學(xué)連接方法(圖2)是以C端為硫酯的多肽與N端為半胱氨酸(Cys)殘基的多肽反應(yīng)得到以Cys為連接位點(diǎn)的多肽。由于連接所合成的多肽必須含Cys殘基,限制了該方法的應(yīng)用。

　　化學(xué)區(qū)域選擇連接方法(圖3)是以2-巰芐基作為輔助基與硫酯反應(yīng)。加快了縮合速度,輔助基易脫除,且去除輔助基連接是以苯胺的衍生物NA-(1-苯基-2-巰乙基)為輔助基團(tuán),對強(qiáng)酸保持穩(wěn)定,使得N端多肽片段較易合成。

　　光敏感輔助基連接方法(圖4)是以NA-2-巰基-1-(2-硝基苯)乙基為輔助基(見光分解易脫除)多肽合成的。

　　施陶丁格連接方法(圖5)是以疊氮反應(yīng)為基礎(chǔ),以C端的膦硫酯和N端的疊氮化合物反應(yīng)生成酰胺膦鹽,酰胺膦鹽水解得到多肽和膦氧化物。

　　正交化學(xué)連接方法是改進(jìn)的施陶丁格連接方法,通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。1.4 組合化學(xué)法[20~25]

　　組合化學(xué)法是20世紀(jì)80年代在固相多肽合成的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它將氨基酸的構(gòu)建單元按某種組合方式連接起來,合成出包含大量化合物的化學(xué)庫,并從中篩選出具有某種物理、化學(xué)或藥理活性化合物的一套合成策略和篩選方案。與傳統(tǒng)合成方法不同的是,傳統(tǒng)合成方法一次只合成一種化合物,而組合化學(xué)法可同時合成多種化合物。常用的合成策略方法主要有:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法[21]等。Dubs等[25]利用化學(xué)選擇平行方法,得到了含有102種兩親性黑色素細(xì)胞刺激素(R-MSH)的類似物的肽庫。經(jīng)藥理測試發(fā)現(xiàn),其中84種化合物的AMPs的誘導(dǎo)性高于已應(yīng)用的R-MSH促效劑Melitane。

　　組合化學(xué)法能最大限度地篩選各種新化合物及其異構(gòu)體,從而首先找到具有藥效作用的先導(dǎo)物,是世界各大醫(yī)藥公司普遍采用的方法。目前面臨的問題是:如何提高合成化合物組合庫的分子多樣性和開發(fā)與之配套的敏感有效的快速分析和鑒定手段。

　　1.5 酶解法[26,27]

　　用酶解法合成多肽,又稱酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白質(zhì),將動植物大分子蛋白質(zhì)降解成小分子活性多肽。酶解蛋白質(zhì)所用的酶,大多數(shù)是肽酶類。近年來,人們運(yùn)用酸、堿降解蛋白質(zhì)獲得多肽收獲甚微,固定投資大,周期長,污染嚴(yán)重,風(fēng)險大,未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。武漢九生堂的鄒遠(yuǎn)東教授利用酶解法開發(fā)出大豆多肽、大豆寡肽、鮑魚肽[26]、海參肽、苦瓜肽[27]、魚翅肽、燕窩肽等一系列多肽產(chǎn)品,在酶法多肽方面做出了杰出貢獻(xiàn)。酶法多肽具有以下優(yōu)點(diǎn):酶解不降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值,可獲得比原食品蛋白質(zhì)更多的功能;可保持多肽營養(yǎng)純天然綠色屬性,不含任何化學(xué)物質(zhì)等。但酶解得到的是一系列多肽,分離純化難度較大,因此不適于合成單一的多肽。另外,肽酶的催化具有專一性,因此,尋找合適的肽酶也是該方法的一個難點(diǎn)。

　　1.6 基因工程法[28]

　　DNA重組技術(shù)的誕生為合成序列確定的多肽奠定了基礎(chǔ),即可通過設(shè)計合適的DNA模板來控制多肽的序列。利用DNA重組技術(shù),可以通過重組DNA產(chǎn)生的工程菌來大量高效地合成多種生物活性多肽。Urry等在大腸桿菌中表達(dá)了似彈性蛋白--聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG),是基因工程技術(shù)應(yīng)用于多肽合成的范例。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的活性多肽還有肽類抗生素[28]、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素、凝血因子、促紅細(xì)胞生成素、組織非蛋白纖溶酶原等�；�因工程法合成多肽具有表達(dá)定向性強(qiáng)、產(chǎn)品安全衛(wèi)生、原料來源廣泛和成本低等優(yōu)點(diǎn),可以得到質(zhì)量高、療效好且具有天然活性的多肽類藥物,但存在高效表達(dá)等技術(shù)難題,分離困難,產(chǎn)率低,成本昂貴,難以用于規(guī)模生產(chǎn)。

　　1.7 發(fā)酵法[29]

　　發(fā)酵法是從培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中提取多肽的方法。目前,微生物能夠獨(dú)立合成的聚氨基酸只有E-聚賴氨酸(E-PL)、C-聚谷氨酸(C-PGA)和聚(L-精氨酸-L-天冬氨酸)(藍(lán)細(xì)菌肽)。發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)是工業(yè)化成本低,但是產(chǎn)物范圍窄,且產(chǎn)物提純復(fù)雜。

　　2 多肽的應(yīng)用

　　目前,多肽的應(yīng)用主要集中在多肽藥物、多肽藥物載體、組織工程材料和多肽營養(yǎng)食品等方面。

　　2.1 多肽藥物[30~35]

　　除了傳統(tǒng)的多肽類激素外,對多肽類藥物的開發(fā)已經(jīng)發(fā)展到疾病防治的各個領(lǐng)域:多肽疫苗可用于SARS病毒[31]、肝炎、艾滋病等病毒性傳染病的預(yù)防;與腫瘤基因靶點(diǎn)特異結(jié)合的多肽可用于治療腫瘤[32~34];從肽庫內(nèi)篩選細(xì)胞因子模擬肽;多個抗菌肽可殺死腫瘤細(xì)胞;天然植物中分離出的一些小肽可治療心血管疾病等。此外,在診斷試劑中多肽的用途主要是用作抗原檢測寄生蟲的抗體,多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強(qiáng),也易于制備,且易于臨床應(yīng)用。

　　2.2 多肽藥物載體[36,37]

　　多肽用作藥物載體,既可以用作藥物載體的修飾劑,也可以作為藥物載體的主要組成部分。Law等[36]設(shè)計了蛋白酶斷裂點(diǎn)連接的肽段在合適的溶劑中自組裝后將藥物包覆在微球內(nèi),遇到靶向蛋白酶使得斷裂點(diǎn)斷開,實現(xiàn)藥物的靶向釋放,如圖6所示。

　　彭師奇等將精氨酸-甘氨酸-天氨酸-絲氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)四肽修飾脂質(zhì)體用作藥物載體導(dǎo)向溶栓。運(yùn)用血小板的纖維蛋白原(FG)受體配基RGDS肽作為導(dǎo)向歸巢裝置,偶聯(lián)于包裹尿激素UK的脂質(zhì)體。載體與藥物之間以酸敏感性共價鍵的形式連接,在自然界或人體內(nèi)能生物降解成內(nèi)源性物質(zhì)Glu,不易產(chǎn)生積蓄和毒副作用。

　　2.3 組織工程材料[38,39]

　　一些不具有生物活性的高分子多肽,如聚天冬氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸等,由于具有良好的生物相容性、可控生物降解速率、可修飾性、設(shè)計的可塑性、結(jié)構(gòu)的可控性等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為組織工程中極具應(yīng)用前景的一類新型材料。Langer等制備了聚(乳酸-賴氨酸),將RGD肽接枝到聚合物中賴氨酸的-NH2上,有效提高了聚合物表面的細(xì)胞粘附能力,克服了主鏈無活性基團(tuán)的不足,獲得的組織工程支架材料既便于細(xì)胞識別,又能支持細(xì)胞生長[39]。

　　2.4 多肽營養(yǎng)食品[40]

　　活性肽類食品作為一種新型保健食品,具有獨(dú)到的特性和功能,在營養(yǎng)學(xué)上也有著許多優(yōu)點(diǎn),在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)來源不同,活性肽營養(yǎng)食品主要有以下幾類:乳蛋白肽類制品、植物肽類制品、膠原肽類制品、畜產(chǎn)類和水產(chǎn)類多肽制品等。