NimbleGen大麥外顯子組捕獲快速定位多節(jié)矮稈突變基因

瀏覽次數(shù)：3262　發(fā)布日期：2014-6-23　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，性狀相關(guān)的基因定位對(duì)于科學(xué)育種十分重要，傳統(tǒng)的遺傳重組定位具有指導(dǎo)意義和實(shí)用價(jià)值，但傳統(tǒng)方法周期長(zhǎng)、耗費(fèi)大。隨著二代測(cè)序的發(fā)展，DNA測(cè)序速度大大加快、成本大大降低，使得通過(guò)測(cè)序法進(jìn)行的基因定位（mapping-by-sequencing）成為越來(lái)越多動(dòng)植物研究的主要手段。對(duì)合適的樣本群體，在完整的基因組參考序列的條件下，結(jié)合傳統(tǒng)集群分離分析(BSA)和二代測(cè)序方法，可以快速定位性狀相關(guān)基因。在短短幾天內(nèi)，可通過(guò)數(shù)據(jù)運(yùn)算界定出基因所在區(qū)域，進(jìn)一步鎖定基因。這一方法已經(jīng)在擬南芥、水稻、玉米、小鼠、斑馬魚(yú)等等的基因定位中得到了應(yīng)用。

通常這一應(yīng)用的前提需要一個(gè)高質(zhì)量、較完整的參考基因組序列，包括所有基因及其他基因組序列信息。然而，在農(nóng)業(yè)中的許多重要作物，如大麥、小麥等等的基因組圖譜并不完整。最近德國(guó)科學(xué)家在Genome Biology上發(fā)表文章¹，介紹了通過(guò)外顯子組二代測(cè)序方法定位一個(gè)影響大麥出葉速率(leaf initiation rate)的基因，表明即使在基因組并不完整的情況下也可以進(jìn)行測(cè)序法的基因定位。

此次研究針對(duì)大麥多節(jié)矮稈突變體(mnd)，這一突變體的最顯著特點(diǎn)是葉間期縮短，出葉速度加快，葉子數(shù)量平均為野生型的2倍，節(jié)間莖稈長(zhǎng)度縮短，并伴有葉子形狀的改變等等。利用X光誘發(fā)的多節(jié)矮稈突變體與野生型cv. Barke雜交獲得F2代，在100個(gè)F2中有19%為突變型、81%為野生型，該性狀為單基因隱性遺傳。取18個(gè)突變體的DNA混合成一個(gè)突變樣本群的DNA混合物，再隨機(jī)選取30個(gè)野生型混合成野生型樣本群的DNA混合物，對(duì)這兩個(gè)DNA混合物分別用NimbleGen大麥外顯子組探針富集大麥基因組的編碼序列后，進(jìn)行二代測(cè)序。

圖：基因定位：通過(guò)突變樣本群和野生樣本群等位基因頻率的差異定位候選基因。摘自Mascher M, Jost M, Kuon JE, Himmelbach A, Aßfalg A, Beier S, Scholz U, Graner A, Stein N. Mapping-by-sequencing accelerates forward genetics in barley. Genome Biol. 2014. Jun 10;15(6):R78

突變樣本群和野生型樣本群分別獲得8.2 Gb和7Gb測(cè)序數(shù)據(jù)，比對(duì)cv. Barke的全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序拼接結(jié)果后，分析SNP位點(diǎn)及其等位基因頻率。比較2個(gè)樣本群的SNP位點(diǎn)等位基因頻率，在染色體5H長(zhǎng)臂發(fā)現(xiàn)一個(gè)30cM區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)突變型的SNP等位基因頻率達(dá)95%，而野生型的SNP頻率僅為30%。同時(shí)，由于X光所引發(fā)的突變多為缺失突變，在測(cè)序數(shù)據(jù)中通過(guò)測(cè)序深度尋找>150bp的缺失突變，發(fā)現(xiàn)有18個(gè)缺失位于上述區(qū)域。在缺失片段對(duì)應(yīng)的contig中，contig 49382位于5H 96 cM，有2個(gè)缺失區(qū)域，是一個(gè)被注釋為“Cytochrome P450”的MLOC_64838.2基因的2個(gè)外顯子。Blastn的結(jié)果顯示這個(gè)基因編碼的蛋白與水稻PLASTOCHRON1 (pla1)基因編碼的蛋白序列相似，pla1基因的突變會(huì)使得水稻有類(lèi)似大麥多節(jié)矮稈突變體的表型，作者認(rèn)為MLOC_64838.2基因很可能是控制這個(gè)形狀的基因。文章還在其他大麥多節(jié)矮稈突變體中進(jìn)行了這個(gè)基因的驗(yàn)證，并在大麥的物理圖譜中定位了這個(gè)基因。作者認(rèn)為，利用大量現(xiàn)有的大麥突變體資源，結(jié)合外顯子組測(cè)序、合理數(shù)據(jù)分析方法以及現(xiàn)有的基因組資源，可以經(jīng)濟(jì)有效地對(duì)大麥進(jìn)行測(cè)序法的基因定位(mapping by sequencing)，同樣的方法也可以用于其他基因組龐大的物種的類(lèi)似研究。

此文中所用的NimbleGen大麥外顯子組探針設(shè)計(jì)基于現(xiàn)有大麥基因組拼接的注釋?zhuān)⒖既L(zhǎng)RNA序列以及RNASeq測(cè)序序列設(shè)計(jì)，總共約88.6Mb目標(biāo)序列，對(duì)應(yīng)目前大麥基因組中~60Mb左右的編碼區(qū)域。大麥外顯子組捕獲產(chǎn)品在一個(gè)捕獲反應(yīng)溶液中有約420萬(wàn)種不同的DNA探針，體現(xiàn)了NimbleGen高密度探針的生產(chǎn)和設(shè)計(jì)能力，可以有效覆蓋和捕獲目標(biāo)區(qū)域。2013年11月在The Plant Journal發(fā)表的一篇文獻(xiàn)2，也運(yùn)用該大麥外顯子組捕獲產(chǎn)品，對(duì)不同品系的種植大麥及野生大麥進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，隨后進(jìn)行SNP發(fā)現(xiàn)、多樣性分析和進(jìn)化分析，文章指出這個(gè)工具可以應(yīng)用于多種品系的大麥、甚至小麥，幫助mRNA編碼區(qū)的變異研究，通過(guò)混合捕獲和減少測(cè)序量大大降低研究成本，從而推進(jìn)大麥遺傳多樣性及基因性狀研究。

1. Mascher M, Jost M, Kuon JE, Himmelbach A, Aßfalg A, Beier S, Scholz U, Graner A, Stein N.Mapping-by-sequencing accelerates forward genetics in barley. Genome Biol. 2014. Jun 10;15(6):R78.

2. Mascher M, Richmond TA, Gerhardt DJ, Himmelbach A, Clissold L, Sampath D, Ayling S, Steuernagel B, Pfeifer M, D'Ascenzo M, Akhunov ED, Hedley PE, Gonzales AM, Morrell PL, Kilian B, Blattner FR, Scholz U, Mayer KF, Flavell AJ, Muehlbauer GJ, Waugh R, Jeddeloh JA, Stein N.Barley whole exome capture: a tool for genomic research in the genus Hordeum and beyond.Plant J. 2013 Nov;76(3):494-505. doi: 10.1111/tpj.12294. Epub 2013 Aug 24.

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