雙向電泳常見問題解答

 

隨著人類基因組草圖完成，蛋白質(zhì)組研究全面展開。作為經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)，雙向電泳越來越被科研人員所熟知。但要想得到漂亮的雙向電泳譜圖，卻并不那么容易。我們將針對(duì)雙向電泳過程中常出現(xiàn)的問題進(jìn)行總結(jié)，希望能給您的實(shí)驗(yàn)帶來幫助。

 

本期我們重點(diǎn)關(guān)注雙向電泳圖譜中常出現(xiàn)的水平條紋。雙向電泳水平條紋的產(chǎn)生主要來自于樣品本身和一向等電聚焦電泳，下面就從這兩方面的原因及其解決辦法進(jìn)行詳述。

 

 

1．樣品中存在影響等電聚焦的雜質(zhì)

蛋白樣品中任何離子凈電荷的污染都將影響等電聚焦，并引起水平條紋。嚴(yán)重的污染物干擾，我們?cè)诘入娋劢惯^程中可以觀察到：低電壓運(yùn)行時(shí)，軟件和儀器監(jiān)測到的電流很快就達(dá)到50 µA的限定，預(yù)設(shè)的高電壓不能達(dá)到；嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致電弧產(chǎn)生或IPG膠條燃燒。常見的污染包括樣品制備過程中引入的鹽和其他帶電小分子、去污劑；以及樣品本身內(nèi)源性的雜質(zhì)，包括各種內(nèi)源性的帶電小分子，核酸、多糖、脂類、酚類等非蛋白雜質(zhì)。了解樣品中主要污染物的組成，并且在樣品制備過程中采取有針對(duì)性的辦法去除污染物即可改善水平條紋。

 

鹽和帶電小分子：水化上樣將鹽離子濃度降低到10 mM以下，而杯上樣則限制樣品鹽濃度不超過50 mM。脫鹽常用脫鹽柱、旋轉(zhuǎn)透析或透析袋；而用TCA和丙酮沉淀再重懸，是一個(gè)更有效的脫鹽方法，但往往TCA清除不盡，蛋白復(fù)溶效率不高。2-D Clean-Up Kit （貨號(hào)80-6484-51）則采用專利的共沉淀劑和洗滌附加物，可以定量沉淀各種來源的蛋白質(zhì)，蛋白復(fù)溶率通常大于90%。使用2-D Clean-Up Kit不會(huì)造成斑點(diǎn)增加或減少，或斑點(diǎn)位置的變化，操作簡單，整個(gè)過程可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。另外，使用劣質(zhì)水、尿素或其他試劑也會(huì)造成導(dǎo)電性升高；尿素還易分解為帶電的產(chǎn)物。選用優(yōu)質(zhì)試劑，重要的試劑包括尿素、硫脲、DTT、去污劑、載體兩性電解質(zhì)、水等，防止一向等電聚焦所需的這些試劑因本身純度不夠，而引入帶電雜質(zhì)。即使選擇了優(yōu)質(zhì)尿素、硫脲，保存得當(dāng)也非常關(guān)鍵。尿素、硫脲吸水后會(huì)發(fā)生離子化，影響等電聚焦。樣品中鹽離子濃度還可以通過改變IEF的程序來降低。先設(shè)一步或幾步低壓程序，如100V 3h，100v---1000v gradient 3h，然后再升高電壓完成IEF，這個(gè)低壓程序可以使樣品中的離子首先遷移到IPG膠條的末端，降低電內(nèi)滲，減少水平條紋的形成。

 

帶電荷的去污劑：最常用的離子型去污劑如SDS，能夠包被蛋白，并徹底改變它們的凈電荷，最終影響它們的等電點(diǎn)，導(dǎo)致條紋出現(xiàn)以及IPG膠條中樣品的損失。如果在樣品中存在SDS，那么其用溶脹液稀釋后的最終濃度不能超過0.25%。或者，添加其他非離子型去污劑或兼性離子去污劑稀釋 SDS的濃度。

 

核酸：樣品的核酸污染也會(huì)導(dǎo)致水平條紋的出現(xiàn)。高分子量的核酸還會(huì)堵塞膠孔，阻礙聚焦。許多蛋白與核酸結(jié)合，產(chǎn)生了蛋白-核酸的混合物，每個(gè)都有著不同的等電點(diǎn)。在等電聚焦之前用核酸酶（貨號(hào)80-6501-42）處理樣品，可去除樣品中的核酸。或者在樣品制備時(shí)超聲剪切核酸，也可在精胺存在時(shí)通過超速離心也可去除核酸。

 

多糖：唾液酸、帶負(fù)電荷的多糖也能產(chǎn)生與核酸類似的水平條紋。不帶電荷的多糖通過阻塞凝膠孔，阻礙樣品進(jìn)入IPG膠條，導(dǎo)致條紋出現(xiàn)。去除多糖用TCA/acetone (Damerval et al. 1986)，或者醋酸銨(甲醇飽和硫酸銨)沉淀然后用苯酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)。

 

2． 蛋白被修飾——氨基甲�；�

為了防止蛋白質(zhì)的修飾，不要在加入尿素后加熱樣本。如果樣本中存在尿素，溶液溫度不能超過37°C。溫度上升會(huì)使尿素水解為異氰酸酯，異氰酸酯能通過氨基甲酰化作用（carbamylation）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，使個(gè)別蛋白產(chǎn)生電荷異質(zhì)性，造成人為的“斑點(diǎn)串（charge trains）”。蛋白樣品應(yīng)當(dāng)使用高純度尿素制備，切勿加熱至30°C以上。

 

3．二硫鍵形成

二硫鍵形成也是樣品制備方面導(dǎo)致水平條紋的一個(gè)重要原因。在雙向電泳之前，若蛋白樣品中存在二硫鍵，則它們是隨機(jī)存在于分子內(nèi)部或分子之間的。二硫鍵形成產(chǎn)生了多種蛋白構(gòu)象，包括較小的pI變體（在雙向凝膠上顯示為單個(gè)蛋白點(diǎn)的變寬）以及同一蛋白的多聚物（以點(diǎn)、幻影點(diǎn)、缺失點(diǎn)的條紋尾和拖尾出現(xiàn)）。防止二硫鍵的形成能避免這些問題。二硫鍵問題在兩種情況下特別嚴(yán)重：1）堿性蛋白的分析，2）較長IPG膠條的使用。樣品制備過程中加還原劑，如DTT，可打開二硫鍵，需要注意的是DTT在IEF過程中會(huì)遷移而使蛋白發(fā)生再氧化。對(duì)于堿性蛋白，采用DeStreak去拖尾試劑（貨號(hào)17-6003-18）和DeStreak去拖尾水化液，可將蛋白質(zhì)巰基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)榉�(wěn)定的二硫化物基團(tuán)，防止發(fā)生非特異性氧化反應(yīng)。結(jié)合在酸性端杯上樣可有效減少堿性蛋白聚焦過程中產(chǎn)生的水平條紋。

 

4．蛋白溶解度差

未能徹底溶解樣品中的所有蛋白將引起水平條紋。雙向電泳最常用的樣品緩沖液中主要組分是尿素、非離子去污劑（如NP-40）或兼性離子去污劑（如CHAPS）及還原劑（如DTT）。此混合物中包含的其他組分，如硫脲或新型去污劑，如氨基硫代甜菜堿家族（如ASB-14）能改善膜蛋白的溶解性。這些試劑的綜合作用是通過更好地溶解蛋白的疏水區(qū)域以減少因蛋白中的氫鍵或與IPG凝膠基質(zhì)的相互作用而產(chǎn)生的聚集。另外，在等電聚焦前通過離心去除不溶蛋白也是一種好的做法，能防止它們干擾其他蛋白進(jìn)入凝膠基質(zhì)。

 

 

1．上樣量太高或存在高豐度蛋白

IPG膠條的載樣量通常取決于膠條的長度、pH范圍以及所使用的染色方法。下表列舉了各種不同膠條推薦的上樣量。高豐度蛋白存在的樣品需要更多考慮。人血清中的白蛋白占蛋白質(zhì)總量的70~90%，IgG占10~25%。利用白蛋白和IgG去除試劑盒（貨號(hào)28-9480-20和28-9466-03）可選擇性地與人白蛋白和IgG結(jié)合并去除，從而改善低豐度蛋白質(zhì)的分辨率，增加樣本的斑點(diǎn)數(shù)量。另外，使用杯上樣的方法上樣時(shí)，上樣量過大，可能會(huì)導(dǎo)致高豐度蛋白過載，從而使蛋白聚集。這會(huì)導(dǎo)致某一蛋白在等電點(diǎn)（pI沉降）沉淀，并引起水平條紋。因此，杯上樣時(shí)需要限制蛋白濃度不超過10mg/ml。

 

表. IPG膠條推薦載樣量

膠條長度	(pH)	推薦上樣量（µg）
		銀染	考染
7	3-11NL, 3-10NL, 3-10	3-6	30-60
	4-7	4-8	25-150
	3-5.6NL, 6-11, 7-11NL	8-16	40-240
13	3-11NL, 3-10NL, 3-10	10-20	50-240
	4-7	15-30	75-450
	3-5.6NL, 6-11, 7-11NL	30-60	150-900
18	3-11NL, 3-10NL, 3-10	20-40	100-500
	4-7	30-60	150-900
	3-7NL, 6-9, 6-11	60-120	300-1500
24	3-11NL, 3-10NL, 3-10	30-60	200-600
	4-7	45-90	200-1300
	3-5.6NL, 3-7NL, 6-9, 7-11NL	80-170	400-2000

 

2．聚焦不足

不完全聚焦也會(huì)引起水平條紋。確保總的伏特小時(shí)數(shù)適用于所使用IPG膠條的長度和pH范圍，并根據(jù)上樣量進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，不同長度和pH范圍的膠條不能同時(shí)電泳。另外，等電聚焦程序設(shè)置了總電流的限制-50uA/膠條，多根膠條同時(shí)聚焦時(shí)，如果某個(gè)樣品離子較多，它將承載大部分電流，減慢了其他蛋白樣品的聚焦。這導(dǎo)致不完全聚焦和水平條紋的出現(xiàn)。因此，電導(dǎo)率相差很大的樣品應(yīng)當(dāng)單獨(dú)運(yùn)行IEF。

 

3．聚焦過度

延長聚焦時(shí)間不一定能提高分辨率。實(shí)際上，它可能引起水平條紋。一些蛋白樣品更易聚焦，因此必須對(duì)每個(gè)樣品類型及每種緩沖液獨(dú)立開展伏特小時(shí)數(shù)的優(yōu)化，以確定穩(wěn)態(tài)的IEF模式。

 

總之，樣品制備和等電聚焦是雙向電泳譜圖出現(xiàn)水平條紋的最主要的原因。除此之外，如果平衡緩沖液或覆蓋膠條的瓊脂糖中存在雜質(zhì)，也可能使整個(gè)膠上出現(xiàn)橫條。這就需要配制新鮮干凈的瓊脂糖和平衡緩沖液。并且，IPG干膠條的水化也非常關(guān)鍵，通常水化時(shí)間要在10h以上。保證整個(gè)膠條均勻、充分溶脹也是去除水平條紋必需的。